论文部分内容阅读
鸡贫血病毒是无囊膜单链环状DNA病毒,属于圆环病毒科环状病毒属,是鸡的一种普遍存在的病原体,可感染雏鸡胸腺细胞和红细胞,引起鸡传染性贫血,在世界范围内分布广泛。Apoptin是鸡贫血病毒的VP3蛋白,因其具有选择性诱导人肿瘤细胞凋亡的能力而被广泛研究,是一种值得关注的抗肿瘤治疗蛋白。作为新的肿瘤治疗方法,我们利用腺病毒载体,构建了一种新型重组腺病毒Ad-VT,该病毒可以特异性表达鸡贫血病毒VP3基因,并利用E1a在癌细胞中选择性复制,该病毒对肿瘤细胞杀伤作用大,对正常细胞杀伤作用小,且比化疗药副作用小。Ad-VT对黑色素瘤、肺癌、乳腺癌和胃癌等多种癌症均具有抗癌疗效,而在膀胱癌中的作用及其确切机制尚不清楚。膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤,手术困难大且容易伴有术后并发症、转移与复发等状况,治疗后疗效往往不尽人意,严重影响患者的生活质量。因此本研究探讨了表达鸡贫血病毒VP3基因的重组腺病毒Ad-VT对膀胱癌的抑制作用及机制研究,期望能够发现治疗膀胱癌的新途径。1.Ad-VT体内外抑瘤作用评价Ad-VT可以对肿瘤细胞特异性识别和感染,并表达Apoptin蛋白,具有双重的抗肿瘤特异性。本部分通过Western blotting和CCK-8检测确定Ad-VT在膀胱癌细胞中的选择性复制,能安全有效的杀伤膀胱癌细胞,且对正常细胞杀伤作用小。基于Apoptin可以诱导细胞凋亡,我们通过流式细胞术和Hoechst染色检测凋亡的情况,结果显示Ad-VT呈时间和剂量依赖性诱导膀胱癌细胞凋亡。为了进一步确定Ad-VT的抗膀胱癌作用,我们建立膀胱癌细胞皮下荷瘤小鼠模型,分析其在体内抑瘤情况,结果显示Ad-VT能够显著提高小鼠生存率,减小肿瘤体积,通过免疫组化和Tunel染色实验显示Ad-VT在肿瘤组织中特异性复制,尚未扩散至其他脏器,安全性好,并且能够诱导凋亡抑制增殖。本部分阐明了在细胞、组织和整体动物水平上,Ad-VT对膀胱癌均具有显著作用,且特异性高,安全性好。2.Ad-VT调节细胞周期机制研究本部分采用流式细胞术和Western blotting检测Ad-VT对UM-UC-3细胞周期的影响,结果显示Ad-VT诱导UM-UC-3细胞G2/M阻滞。为了确定UM-UC-3细胞周期阻滞是由Ad-VT复制引起的,我们采用细胞周期同步化的方法,通过流式细胞术和病毒滴度检测,结果显示UM-UC-3细胞的G2/M阻滞促进了Ad-VT的复制。通过检测Ad-VT感染后UM-UC-3细胞内c AMP含量的变化,发现Ad-VT能够显著诱导UM-UC-3细胞内c AMP含量的增加,同时Western blotting结果显示Ad-VT感染UM-UC-3细胞后能激活AMPK信号通路,且使用c AMP抑制剂能下调AMPK表达量,提示Ad-VT通过上调c AMP激活AMPK信号通路诱导UM-UC-3细胞G2/M期阻滞。为了进一步验证AMPK通路能够干扰Ad-VT诱导的UM-UC-3细胞的G2/M期阻滞,我们采用了AMPK过表达、抑制剂和小干扰RNA,通过流式细胞术和Western blotting检测发现Ad-VT通过AMPK通路诱导膀胱癌细胞G2/M期阻滞。最后我们使用CCK-8和小鼠体内荷瘤验证Ad-VT通过AMPK信号通路调节抑瘤作用,AMPK抑制剂、Raptor si RNA与Ad-VT联合应用在体内外均能显著降低Ad-VT引起的抗肿瘤作用。本部分阐述了Ad-VT通过上调c AMP激活AMPK-Raptor-m TOR通路引起了膀胱癌细胞G2/M期阻滞,进一步促进Ad-VT的复制,调节AMPK信号通路会影响Ad-VT对膀胱癌的抗肿瘤作用。3.Ad-VT调节自噬过程机制研究本部分通过Western blotting检测出Ad-VT能够诱导膀胱癌细胞自噬,同时采用了MDC染色和m Cherry-EGFP-LC3自噬流检测,发现Ad-VT诱导膀胱癌细胞发生自噬。为了确定自噬是否直接参与Ad-VT诱导的癌细胞死亡,我们通过CCK-8检测自噬激活剂和抑制剂对Ad-VT作用的影响,结果提示自噬促进了Ad-VT诱导的细胞死亡。另外使用Atg5 si RNA发现Atg5基因敲降减少了Ad-VT感染引起的细胞死亡,提示Atg5是Ad-VT诱导细胞死亡的关键蛋白之一。同时进行小鼠荷瘤实验发现,Atg5 si RNA与Ad-VT联合应用显著降低了Ad-VT治疗的抗肿瘤效果。接下来研究Ad-VT诱导的自噬调节通路,通过Western blotting检测发现,Ad-VT通过AMPK-Raptor-m TOR通路显著增强自噬并诱导癌细胞死亡,而Akt-TSC2-m TOR通路在这一过程中起负作用。最后在荷瘤小鼠体内研究发现Ad-VT与自噬激活剂雷帕霉素联合应用,与单一治疗相比能够更有效抑制肿瘤生长,维持小鼠生存。本部分阐述了Ad-VT可通过AMPKRaptor-m TOR通路诱导膀胱癌的自噬抗肿瘤活性,而联合自噬激活剂雷帕霉素可进一步提高这一活性。综上所述,Ad-VT对膀胱癌有显著的抑制作用,且通过诱导细胞周期阻滞和自噬两种机制发挥抗膀胱癌作用。