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慢性肝脏炎症,导致肝纤维化,继而发展为肝癌,是严重危害人类的难治性重大疾病。深入研究并揭示肝病的发病机制,尤其从细胞和分子水平阐明肝纤维化-肝癌发生过程,从而靶向干预特定的细胞和分子,是延缓或阻断肝病进程的新策略。肝星状细胞(Hepatic stellate cell,HSC),被认为是各种致纤维化因素作用的直接靶细胞,其被激活进而异常合成分泌以胶原为主的细胞外基质(Extracellular matric,ECM)和自身细胞表型转化为肌成纤维细胞(Myofibroblast,MFB),从而导致肝脏的重构,是肝纤维化发生的中心事件。转化生长因子-β1(Transforming growth factor beta-1,TGF-β1),是被证实的最强有力的促肝纤维化细胞因子,由其介导的TGF-β/Smad信号通路在肝纤维化和肝癌发病过程中被异常激活。本课题组前期研究表明,中药复方制剂复方芪参提取物(Compound Astragalus and Salvia miltiorrhiza extract,CASE)对四氯化碳(Carbon tetrachloride,CCl4)诱导的急性和慢性肝损伤都有明显的肝保护作用;近期研究发现CASE对二乙基亚硝胺(Diethylinitrosamine,DEN)诱导的肝细胞癌发生也有延缓和改善作用。本研究通过整体实验(DEN诱导大鼠肝纤维化-肝癌模型)进一步观察CASE的抗肝纤维化-肝癌作用,并结合细胞实验(HSC和HepG2)深入探究其分子机制。目的1.在前期已经证明CASE能改善肝功能相关血清学指标、降低肝癌发生率和多样性的基础上,通过苏木精-伊红染色对肝组织进行组织病理学分析,评估CASE对DEN诱导的大鼠肝纤维化-肝癌发生过程中组织病理学改变的影响。2.观察DEN诱导的大鼠肝纤维化-肝癌模型及CASE干预下,TGF-β1、I型TGF-β受体(TβRI)、II型TGF-β受体(TβRII)及Smad2/3磷酸化蛋白(pSmad2C、pSmad2L、psmad3c、psmad3l)水平变化,分析den诱导的大鼠肝纤维化-肝癌发病机制与tgf-β/tβr/smad2/3信号转导的关系及case抗肝纤维化-肝癌作用与其关联性。3.观察case对tgf-β1活化的hsc和hepg2细胞中tβri、tβrii蛋白水平的影响,分析case对tβri、tβrii是否有直接调控作用。方法1.整体动物实验,观察case对den诱导的大鼠肝纤维化-肝癌的作用并探究可能的分子机制成年雄性sd大鼠,随机分为正常对照组、den模型组、case三个剂量组(60,120,240mg/kg)及阳性药护肝片组(921mg/kg)。den组、case组、护肝片组大鼠灌胃(ig)给予den(0.2%den10mg/kg/次,每周5次),正常组给予等量的溶媒(5g/l羧甲基纤维素-钠,即0.5%cmc-na),共计14周;case组、护肝片组大鼠同时灌胃给予相应剂量的药物,正常组、den模型组给予相应溶媒(0.5%cmc-na)处理,共计16周。分别于造模第12周、第16周两个时间点分批处死大鼠,收集肝脏组织,部分肝脏固定、石蜡包埋,制作组织芯片,苏木精-伊红(he)染色观察肝组织的病理学改变;免疫组化染色法检测肝组织中tgf-β1、tβri、psmad2c、psmad2l、psmad3c、psmad3l蛋白水平及组织中分布。部分肝脏低温冻存,分批解冻,提取细胞总蛋白,免疫印迹法(westernblot)检测肝组织中tgf-β1、tβri、tβrii蛋白水平,以gapdh为内参;免疫沉淀(immunoprecipitation,ip)及免疫印迹法检测psmad3c、psmad3l蛋白水平,以smad3为内参。2.体外细胞实验,观察case对tgf-β1诱导的hsc、hepg2细胞中tβri、tβrii蛋白水平的影响体外培养hsc、hepg2细胞,取对数生长期细胞进行实验。实验分为溶媒对照组、tgf-β1组(40pmol/l)、case三个剂量组(20,40,80μg/ml),于培养结束前24h更换无血清培养基,case组加入相应剂量药物;培养结束前1h,tgf-β1组、case组加入tgf-β1共培养,对照组加入等体积溶媒(不含血清的培养基)。培养结束后,收集细胞,提取细胞总蛋白,采用westernblot法检测样本中tβri、tβrii蛋白水平。结果1case延缓den诱导的大鼠肝纤维化-肝癌病理进程,并干扰tgf-β/tβr/smad2/3信号转导1.1case对抗den诱导的大鼠肝纤维化-肝癌的病理改变对照组大鼠肝脏表面光滑而有光泽、质地柔软,边缘锐利;肝小叶结构完整。den造模第12周大鼠肝脏表面粗糙呈颗粒状、质地硬,边缘变钝;肝小叶被胶原束包绕并分割,假小叶形成。造模第16周大鼠肝脏表面粗糙不平,形成大小不等的结节,经初步鉴定为癌结节;病理检测显示结节内肝细胞异型性明显,核大深染,证实为肝细胞癌。case治疗组大鼠肝脏病变有明显改善,表现在第12周肝硬化结节数目减少和纤维化程度减轻,第16周肝癌结节数目减少和肝癌细胞分化程度提高。1.2case降低den诱导的大鼠肝纤维化-肝癌组织中tgf-β1蛋白水平den诱导的大鼠肝纤维化-肝癌发展进程中,tgf-β1蛋白水平持续上调,免疫组化检测显示,在癌旁组织、癌组织中皆可见tgf-β1蛋白高表达,而case呈浓度依赖性地降低tgf-β1蛋白表达。1.3case下调den诱导的大鼠肝纤维化-肝癌组织中tβri蛋白水平den造模第12周大鼠肝组织中,tβri蛋白水平显著上调,而case呈浓度依赖性地降低tβri蛋白表达;第16周,tβri,在癌旁组织中呈现高表达,而在癌组织中微弱表达,case能够降低肝组织中tβri蛋白表达。1.4case下调den诱导的大鼠肝纤维化-肝癌组织中tβrii蛋白水平den诱导的大鼠肝纤维化-肝癌发展进程中,tβrii蛋白水平持续上调,而case呈浓度依赖性地降低tβrii蛋白表达。1.5case抑制den诱导的大鼠肝纤维化-肝癌组织中smad2c-末端和连接区磷酸化(psmad2c/l)DEN诱导的大鼠肝纤维化-肝癌发展进程中,pSmad2C、pSmad2L蛋白水平持续上调,尤其在癌前病变组织,而CASE三个剂量组,皆能显著抑制Smad2 C-末端和连接区的磷酸化。1.6 CASE调控DEN诱导的大鼠肝纤维化-肝癌组织中Smad3 C末端和连接区磷酸化(pSmad3C/L)DEN诱导的大鼠肝纤维化-肝癌发展进程中,pSmad3L蛋白水平持续上调、pSmad3C微有波动;CASE呈浓度依赖性地降低pSmad3L而升高pSmad3C蛋白水平。2 CASE下调TGF-β1活化的HSC、HepG2细胞中TβRI、TβRII蛋白水平在TGF-β1刺激下,HSC、HepG2细胞中,皆可见TβRI、TβRII蛋白表达增加,而CASE预处理组,可抑制或逆转由TGF-β1刺激引起的TβRI、TβRII上调现象。结论1.CASE能显著延缓DEN诱导的大鼠肝纤维化-肝癌的病理进程。2.CASE抗肝纤维化-肝癌作用与调控细胞因子TGF-β1生成有关。3.CASE可能直接靶向调控膜受体TβRI、TβRII而发挥抗肝纤维化-肝癌作用。4.CASE降低pSmad2C、pSmad2L、pSmad3L蛋白水平而升高pSmad3C蛋白水平,提示CASE抗肝纤维化-肝癌作用与调控Smad2/3 C末端和连接区磷酸化有关。