绢丝昆虫柳蚕异柠檬酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

来源 :安徽农业大学 | 被引量 : 5次 | 上传用户:feixiang20090911
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异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)是生物中一种重要的有脱羧作用的氧化还原酶,在生物中有NAD-依赖型的异柠檬酸脱氢酶和NADP-依赖型的异柠檬酸脱氢酶两种形式。异柠檬酸脱氢酶不仅在氨基酸和维生素合成、能量代谢中扮演重要角色,而且在三羧酸循环和乙醛酸旁路的碳通量分配中起关键性调控作用,因此异柠檬酸脱氢酶是国际上公认的研究蛋白质结构与功能、酶的催化与调节机制、代谢途径最好模型之一。   近期对IDH的研究很多,包括:NADP-IDH的生物学特性中的底物及辅酶专一性,金属离子的影响,最适pH、最适温度及热稳定性,化学修饰剂等以及NADP-IDH的空间结构特点,NADP-IDH的调节、催化等作用机制。这些研究为我们更清楚的认识其在生物体代谢和功能等方面的作用提供了较好的理论依据。   到目前为止,人,小鼠,斑马鱼,果蝇,恶性疟原虫,家蚕,大豆等的NADP-异柠檬酸脱氢酶序列已进行了解析,它们的异柠檬酸脱氢酶具有一定的同源性,为了弄清柳蚕异柠檬酸脱氢酶序列的特性及其与其它物种的关系,从而能够更加系统的研究异柠檬酸脱氢酶的特点,更好地开发利用柳蚕资源,根据已报道的NADP-异柠檬酸脱氢酶基因的保守性序列设计引物,从柳蚕蛹脂肪体中提取RNA,并反转录成cDNA为模板进行基因克隆、测序。获得的柳蚕NADP依赖性异柠檬酸脱氢酶序列全长1317bp,编码439个氨基酸,含有异柠檬酸脱氢酶保守性结构,与家蚕异柠檬酸脱氢酶的氨基酸序列同源性达95%,这也从另一方面证明了柳蚕与家蚕两者之间的进化关系。选择柳蚕转录延长因子为内参,并提取柳蚕蛹中的头、血液、精巢、脂肪体的RNA并反转录,半定量PCR检测结果表明,异柠檬酸脱氢酶在蛹不同组织中均有表达,表达量没有显著差异,这与异柠檬酸脱氢酶广泛的生物学功能是一致的。试验所解析的柳蚕NADP-异柠檬酸脱氢酶序列已登录GenBank,登录号为FJ959347。
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