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背景随着骨科临床医疗技术的进步,关节置换、骨折内固定、韧带和肌腱的重建等植入物相关手术已成为重建患者肢体运动功能的重要手段。然而内植物相关感染以及其他原因导致的骨关节感染会给患者带来灾难性的后果。如何采取相应措施降低内植物相关感染的发病率成为了骨科医疗领域一项重要课题。对此,目前的研究集中于研发自身具有抗感染性能的新型生物材料,这成为了预防和治疗内植物相关骨关节感染的新策略。纯镁金属及镁合金是一种具有较大临床应用潜力的新型可降解内植物材料,而本课题的前期研究发现其在体液环境中降解所产生的碱性微环境可以对骨科常见致病细菌产生较强的抗感染作用,这提示我们对镁基金属的进一步抗感染改性(如合金化,涂层化)有望增强其抗感染性能,同时优化其生物适配性,使其成为一种预防和治疗内植物相关感染,骨髓炎等骨关节感染相关疾病的新型医疗手段。目的:1.本研究旨在以治疗和预防骨关节感染为主要临床应用方向,探索不同途径的镁基金属抗感染改性方式:(1)镁基金属功能合金化改性(2)功能涂层表面改性,制备具有抗感染性能的新型镁基金属内植物材料。2.对不同改性镁基金属的体外离子溶出行为、降解途径、生物安全性、抗菌性能和骨诱导活性进行深入研究,建立动物感染模型,对其在体内的抗感染行为进行系统研究。3.在基因水平研究不同改性镁基金属材料的抗感染效应的作用靶点(包括对细菌毒力,生物膜形成,耐药相关基因的调控和影响),从而阐明并深入探讨其抗感染作用机制。4.通过本课题研究进一步提高镁基金属的抗感染性能,并优化材料的生物相容性和生物活性以期适应其在临床治疗中的实际需求,为其临床转化提供理论基础和依据。方法和结果:1.MRSA诱导大鼠内植物相关感染模型评估纯镁金属内植物的抗感染性能:建立耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA,methicillin-resistant Staphylococcus aureus)诱导的SD大鼠(Sprague Dawley rats)股骨内植物相关感染模型。结果表明纯镁金属内植物降解所产生的碱性微环境可对MRSA产生较强的抑制和杀灭作用,并可显著下调生物膜形成相关的黏附多糖调控基因ica A以及ph值相关基因agr RNAIII的表达,在体内实验中纯镁金属内植物可有效预防和治疗内植物相关感染的发生和发展。2.可降解镁铜合金内植物治疗兔胫骨骨髓炎的抗感染性能及生物安全性研究:合成含铜质量比分别为0%,0.05%,0.1%和0.25%的镁铜合金样品(Mg0Cu,Mg0.05Cu,Mg0.1Cu和Mg0.25Cu),扫描电镜(FESEM)对样品微观形貌结构进行表征;获取材料浸提液,电感耦合等离子体质谱法建立样品金属离子释放动力学模型。CCK-8(cell counting kit-8)法绘制细胞增殖曲线;激光共聚焦显微镜和FESEM下分别观察材料表面细菌的荧光强度以及细菌形态改变;进行菌落计数(CFUs/cm2),测定抑菌效率;结晶紫定量细菌生物膜形成;q PCR(quantitative real time-polymerase chain reaction)检测细菌生物膜形成相关基因的表达,包括ica A、ica B、ica C、ica D和ica R,细菌毒力相关基因aap、alt E、bhp、fbe、embp和抗生素耐药相关基因mec A。以MASA为病原菌建立兔胫骨骨髓炎动物模型;患肢髓腔置入Mg0.25Cu髓内针(Φ2×30 mm);通过影像学、组织学染色、分子生物学等对镁铜合金在体内的抗感染行为进行系统研究。结果表明Mg0.1Cu和Mg0.25Cu镁铜合金样品能够显著抑制细菌生物膜的形成,具有较高的抑菌效率,能够显著下调细菌生物膜毒力和抗生素耐药相关基因的表达。Mg0.25Cu髓内针能够有效治疗兔胫骨骨髓炎,同时修复感染造成的骨组织缺损,无明显局部或全身副作用,在器官和组织无明显的金属离子蓄积。3.可降解镁-钕-锌-锆-银(Mg-Nd-Zn-Zr-Ag)合金内植物治疗兔胫骨骨髓炎的抗感染性能及生物安全性研究:合成含银质量比分别为0%,0.26%,0.56%和1.1%的Mg-Nd-Zn-Zr-Ag合金样品(Mg-Nd-Zn-Zr-0Ag,Mg-Nd-Zn-Zr-0.26Ag,Mg-Nd-Zn-Zr-0.56Ag和Mg-Nd-Zn-Zr-1.1Ag),扫描电镜(FESEM)对样品微观形貌结构进行表征;获取材料浸提液,CCK-8(cell counting kit-8)法绘制细胞增殖曲线;激光共聚焦显微镜下观察材料表面细菌的荧光强度改变;进行菌落计数(CFUs/cm2),测定抑菌效率;结晶紫定量细菌生物膜形成;以MASA为病原菌建立兔胫骨骨髓炎动物模型;患肢髓腔置入Mg-Nd-Zn-Zr-1.1Ag髓内针(Φ2×30mm);通过影像学、组织学染色、分子生物学等对镁铜合金在体内的抗感染行为进行系统研究。结果表明Mg-Nd-Zn-Zr-1.1Ag镁银合金样品能够显著抑制细菌生物膜的形成,具有较高的抑菌效率。Mg-Nd-Zn-Zr-1.1Ag髓内针能够有效治疗兔胫骨骨髓炎,同时修复感染造成的骨组织缺损,无明显局部或全身副作用。4.在多孔镁材料表面修饰庆大霉素载药涂层(Gent-PLGA-Mg):使用聚乳酸-羟基乙酸共聚物(Poly lactic-co-glycolic acid,PLGA)作为庆大霉素的负载缓释基质,并将其作为药物涂层制备于多孔镁支架(porous magnesium scaffold)表面,采用化学反应比色法(o-phthaldialdehyde method)测定庆大霉素浓度的标准曲线方程,计算各组材料上庆大霉素总负载量,144小时内的庆大霉素释放量,建立药物缓释过程的动力学模型。接种人骨髓间充质干细胞(h MSCs)于不同材料表面共培养,分析其对细胞增殖的影响,绘制增殖曲线;采用细胞骨架染色,利用激光共聚焦显微镜(CLSM)观察测细胞在材料表面的铺展形态。检测庆大霉素对标准菌ATCC35984(表皮葡萄球菌)和ATCC25923(金黄色葡萄球菌)的最低抑菌浓度;以复合染料染色,在激光共聚焦显微镜(CLSM)下观察活菌和死菌的荧光强度;进行细菌涂板、计数菌落(CFUs/cm2),测算抑菌效率;采用结晶紫染色法,测定脱色溶液OD值,定量分析材料表面细菌生物膜形成情况。结果显示其具备较高的抗生素负载效率和持久稳定的缓释性能,从而抑制材料表面的早期细菌粘附,降低骨缺损修复术后的感染率,同时进一步提高了其生物相容性和生物活性。5.在多孔镁材料表面修饰依诺沙星载药涂层(Enox-PLGA-Mg):使用聚乳酸-羟基乙酸共聚物(Poly lactic-co-glycolic acid,PLGA)作为庆大霉素的负载缓释基质,并将其作为药物涂层制备于多孔镁支架(porous magnesium scaffold)表面,测定依诺沙星浓度的标准曲线方程,计算各组材料上依诺沙星总负载量,144小时内的依诺沙星释放量,建立药物缓释过程的动力学模型。接种Balb/c小鼠胚胎成纤维细胞(Balb/c 3T3 cells)于不同材料表面共培养,分析其对细胞增殖的影响,绘制增殖曲线;检测依诺沙星对标准菌ATCC35984(表皮葡萄球菌)和ATCC25923(金黄色葡萄球菌)的最低抑菌浓度;以复合染料染色,在激光共聚焦显微镜(CLSM)下观察活菌和死菌的荧光强度;进行细菌涂板、计数菌落(CFUs/cm2),测算抑菌效率;采用结晶紫染色法,测定脱色溶液OD值,定量分析材料表面细菌生物膜形成情况。使用骨髓来源巨噬细胞(BMM Cell,Bone marrow-derived macrophages)定向诱导分化培养获得成熟破骨细胞。抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP,tartrate-resistant acid phosphatase)染色观察各组材料浸提液共培养下对细胞向破骨细胞分化的影响。q PCR检测BMM细胞在与各组材料浸提液共培养过程中,RANKL(nuclear factor-κB ligand)诱导的破骨细胞分化相关基因表达:包括TRAP,cathepsin K[Ctsk],calcitonin receptor[CTR],c-fos,and NFATC1。结果显示其具备较高的药物负载效率和持久稳定的缓释性能,从而抑制材料表面的早期细菌粘附,降低术后感染率,同时可有效抑制破骨细胞分化,有利于修复继发于感染的骨质破坏和骨溶解。结论:1.纯镁金属降解所产生的碱性微环境可显著抑制细菌生物膜的形成,且显示出一定成骨诱导活性,提示镁基金属材料具有预防内植物相关感染的应用潜力,但由于纯镁抗菌作用仅依赖于碱性环境,其抗菌性能受到降解速率的影响而无法保持稳定,需要进一步进行抗感染改性优化。2.镁铜(Mg-0.25Cu)合金具有理想的抗感染性能和较好的生物安全性,在本课题实验中能够有效治疗和预防兔胫骨骨髓炎,并通过抑制细菌生物膜、毒力、抗药性相关基因抑制骨科感染常见致病菌的生物膜形成,可作为替代抗生素链珠、抗生素骨水泥的新型内植物材料,但其降解速率较快,暂不建议作为骨缺损修复材料使用。3.Mg-Nd-Zn-Zr-1.1Ag合金在体外能够有效抑制细菌增殖及生物膜形成,在保持了良好的力学性能的同时,在体内能够有效控制骨髓炎的发展,且其体内降解速率较慢,有希望作为一种骨髓炎相关骨缺损修复材料应用于临床。4.通过在多孔镁表面进行功能涂层改性的两种载药涂层Gent-PLGA-Mg和Enox-PLGA-Mg延缓了镁金属内植物的降解,改善了其生物相容性,能够实现对抗生素药物的高效负载和持久稳定的缓释释放,从而达到理想的预防内植物早期感染的效果,因此具有作为镁金属内植物抗菌改性涂层的应用潜力。5.通过本课题对镁基金属的几种抗感染改性方法的探索和研究,提出了镁基金属在预防和治疗骨科感染性疾病的几种应用形式,为此类临床器件的研发提供了初步的理论基础和转化依据。