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目的:1.观测不同阶段人软骨终板(CEP)组织中印度刺猬蛋白(Ihh)的表达情况;2.体外培养CEP软骨细胞,观测Ihh表达对软骨终板退变的意义。方法:第一部分:人软骨终板不同阶段标本中Ihh蛋白表达及其意义1.收集2018年5月至2018年12月在我院手术治疗腰椎骨折、腰椎退变伴有终板ModicⅠ和Ⅱ型患者的软骨终板标本。2.使用蛋白印迹(Western-blot)和实时定量聚合酶链反应法(RT-qPCR)检测Ihh、软骨正性保护指标(ColⅡ、Sox9)和软骨肥大化指标(Runx2、MMP-13)表达,并通过对蛋白灰度值和mRNA的表达水平分析。第二部分:人软骨终板细胞体外实验研究1试剂干预研究1.体外分离软骨细胞培养至第3代,分为3组:对照组、Ihh组和抗Ihh组。2.分别添加PBS、Ihh重组蛋白液和抗Ihh蛋白液后,培养3-5天,使用Westernblot和RT-qPCR测定检测标本Ihh及相关指标表达情况,免疫组化和原位杂交染色。分析相关蛋白灰度值和mRNA的相对表达水平,平均光密度值。2质粒转染研究1.体外分离软骨细胞培养至第3代,分为3组:过表达组、空载体组和敲减组,分别使用Ihh mRNA、空载体和Ihh siRNA重组质粒转染软骨细胞,培养48h。2.使用Western-blot和RT-qPCR测定检测标本Ihh及相关指标表达情况,免疫组化和原位杂交染色。分析相关蛋白灰度值和mRNA的相对表达水平,平均光密度值。结果:第一部分:人ModicⅠ型和Ⅱ型椎板炎软骨终板组织标本中Ihh蛋白及mRNA相对表达水平较正常组织中增高。与正常组织相比,软骨正性保护指标ColⅡ、Sox9表达降低(p<0.05),而软骨肥大化指标Runx2、MMP-13表达增高(p<0.05)。结果中,ModicⅠ型与Ⅱ型软骨组织中的表达无差异性(p>0.05)。第二部分:1.原代CEP组织软骨细胞呈类圆形,细胞贴壁后呈短梭型,传至第3代贴壁细胞呈短梭型,三角型细胞体积较小,折光性好。添加试剂后的3组细胞,Ihh组同一光镜视野(40x)下可见长梭型细胞比对照组及抗Ihh组多。Ihh组中Ihh及Runx2、MMP-13 mRNA指标表达量相对较高,Sox9 mRNA的表达相对量较低(p<0.05),ColⅡmRNA相对表达量较低但无统计学差异(p>0.05)。抗Ihh组中ColⅡmRNA的表达相对量较高,Ihh、Runx2、MMP-13 mRNA相对表达量较低(p<0.05),Sox9 mRNA相对表达量较低但无统计学差异(p>0.05)。Western-blot灰度值分析提示Ihh组中Ihh蛋白、MMP-13灰度较强,ColⅡ较弱,抗Ihh组中则相反,灰度值分析结果显示Ihh、MMP-13在Ihh组中相对表达量较多,ColⅡ在抗Ihh组中较多(p<0.05)。染色显示出相应的结果,与对照组相比,通过对应颗粒平均光密度值分析,Ihh组Ihh,MMP-13表达较多,ColⅡ较少(p<0.05),抗Ihh组则相反。2.过表达组软骨细胞失分化,死亡较多,空载体组软骨细胞可见多角型,短梭型,敲减组软骨细胞可见短梭型,体积较小。过表达组中Ihh及Runx2、MMP-13 mRNA指标表达量相对较高,Sox9 mRNA的表达相对量较低(p<0.05),ColⅡmRNA相对表达量较低但无统计学差异(p>0.05)。敲减组中ColⅡmRNA的表达相对量较高,Ihh、Runx2、MMP-13 mRNA相对表达量较低(p<0.05),Sox9 mRNA相对表达量较低但无统计学差异(p>0.05)。Western-blot灰度值分析提示过表达组中Ihh蛋白、MMP-13灰度较强,ColⅡ较弱,敲减组中则相反,灰度值分析结果表明Ihh、MMP-13在过表达组中相对表达量较多,ColⅡ在敲减组中较多(p<0.05)。染色显示出相应的结果,与空载体组相比,通过对应颗粒平均光密度值分析,过表达组Ihh,MMP-13表达较多,ColⅡ较少(p<0.05),敲减组则相反。结论:1.ModicⅠ和Ⅱ型CEP组织中Ihh蛋白表达增高,在正常组织表达减少;2.软骨终板细胞中Ihh表达增高,导致软骨终板退变,Ihh表达降低有助于维持细胞表型,延缓退变。