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缺血性心脏病在全球范围内具有高发病率和高死亡率,疏通冠状动脉阻塞并及时恢复血供被认为是最有效的治疗办法。然而,当缺血的组织恢复血流灌注,缺血时造成的损伤却进一步加重的现象,称为心肌缺血再灌注（ischemia reperfusion,I/R）损伤。ROS过量生成引起的氧化应激是I/R损伤重要发病机制之一。研究表明,心肌I/R损伤与ROS/JNK信号通路激活有关。我们前期在I/R离体模型上进行研究,发现缺氧复氧（hypoxia/reoxygenation,H/R）引起的ROS生成可导致胞浆中JNK磷酸化激活,并转位至线粒体外膜上与SH3结构域结合蛋白5结合,启动下游信号通路促使线粒体内ROS生成加剧,进而引起线粒体氧化激损伤及全细胞H/R损伤。Mito-Tempo（MT）是一种易于穿过脂质双分子层并在线粒体内大量蓄积的新型靶向线粒体抗氧化剂,能够高效地清除线粒体内ROS。虽有研究表明MT对与氧化应激密切相关的一些疾病有良好的治疗效果,也有研究显示,MT可以改善心脏来源的H9c2细胞的H/R损伤,但MT对更接近病理状态的心肌I/R整体模型作用效果及机制尚不清楚。本课题组借助结扎左冠状动脉前降支手术构建小鼠I/R模型,探讨MT能否改善心肌I/R损伤并保护心功能。在此基础上,研究MT的保护作用是否与清除过量生成的ROS进而抑制胞浆JNK激活及其线粒体转位有关。方法:1.结扎C57BL/6JNifdc小鼠左冠状动脉前降支制作心肌I/R模型。2.实验分组如下:（1）Sham组;（2）Sham+MT组;（3）Model组（即各时程的I/R组）;（4）Model+0.5 mg/kg MT（0.5 mg/kg MT组）;（5）Model+1.0 mg/kg MT组（1.0 mg/kg MT组）;（6）Model+2.0 mg/kg MT组（2.0 mg/kg MT组）。3.给药方式及时间点:左冠状动脉前降支结扎前15 min分别于尾静脉注入不同剂量的MT。4.分别采用研磨珠匀浆法、乳化分散仪法、玻璃匀浆器法将小鼠的心肌组织进行匀浆,差速离心法分离线粒体。5.JC-1法检测分离线粒体膜电位。6.生化方法检测小鼠血清中肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脱氢酶（LDH）和心肌肌钙蛋白（c Tn-I）的含量。7.伊文思蓝/氯化三苯四氮唑染色检测小鼠心肌梗死面积与缺血区面积。8.石蜡切片进行HE染色,观察小鼠心肌组织形态结构。9.透射电子显微镜观察心肌纤维、线粒体与微血管超微结构。10.硫代巴比妥酸法检测小鼠心肌组织中脂质过氧化产物丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量。11.超声心动图检测小鼠的心功能,包括左室射血分数（Left ventricular ejection fraction,LVEF）、左室短轴缩短率（Left ventricular short axis shortening rate,LVFS）、左室收缩末期容积（Left ventricular end-systolic volume,LVESV）、左室舒张末期容积（Left ventricular end-diastole volume,LVEDV）、左心室舒张末期内径（Left ventricular inner diameter at end-diastole,LVIDd）和左心室收缩末期内径（Left ventricular inner diameter at end-systole,LVIDs）。12.DHE与Mito-SOX染色分别检测心肌组织总ROS与线粒体ROS水平。13.Western blot法检测胞浆与线粒体p-JNK和总JNK等蛋白表达水平。结果:1.缺血45min再灌注15～120 min范围内,随着再灌注时间的延长,心肌组织蛋白中pJNK蛋白水平呈先高后低的变化趋势,在再灌注15 min时p-JNK蛋白水平达到最高峰,而再灌注60 min后即开始逐渐下降。2.与Sham组比较,Model组小鼠再灌注早期血清各种心肌酶含量增加,晚期心肌组织局部出现明显的梗死。MT可以抑制以上损伤性改变,且呈剂量依赖性。3.与Sham组比较,Model组小鼠心肌组织形态结构发生明显变化,表现为心肌纤维断裂溶解、间隙扩大,炎性细胞浸润,且肌纤维间隙中有大量红细胞渗出,MT可明显改善以上形态结构的损伤。同时,透射电子显微镜可以观察到,Model组肌原纤维与线粒体嵴紊乱,微血管内皮细胞肿胀,MT可改善以上超微结构的损伤。4.与Sham组比较,Model组心肌组织MDA含量明显增加,差异有统计学意义（P<0.05）。随着MT剂量的增加,I/R小鼠心肌组织中MDA的生成逐渐减少,其中高剂量MT（2.0mg/kg）作用最明显。5.与Sham组比较,Model组LVEF与LVFS均明显下降,而LVEDV、LVESV、LVIDd、LVIDs等指标明显上升。MT可以剂量依赖地增加LVEF与LVFS,降低LVEDV、LVESV、LVIDd和LVIDs。6.与Sham组比较,Model组总ROS和线粒体ROS生成增多,胞浆JNK异常激活并转位于线粒体。与Model组比较,MT组总ROS和线粒体ROS含量,以及胞浆与线粒体p-JNK蛋白表达水平均明显下降,差异有统计学意义（P<0.05）。7.与Sham组比较,Model组小鼠心肌组织内PGC-1α表达水平降低,差异有统计学意义（P<0.05）。给予MT后PGC-1α表达水平明显升高。8.三种匀浆方式均能获得高纯度的线粒体,且提取效率的差异无统计学意义。与研磨珠匀浆法相比,乳化分散仪法和玻璃匀浆器法得到的线粒体膜电位降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。研磨珠匀浆法得到的线粒体形态结构完整,而乳化分散仪法与玻璃匀浆器法得到的线粒体部分形态结构不完整或破碎。结论:1.MT可以剂量依赖地改善I/R心肌组织形态结构的损伤,减少心肌酶的漏出,缩小梗死面积,保护心功能。2.MT具有清除胞浆及线粒体ROS,抑制胞浆JNK激活与线粒体转位,以及保护心肌组织线粒体的作用,这可能是其拮抗心肌I/R损伤的重要机制。3.研磨珠匀浆法结合差速离心法保证了分离线粒体形态结构的完整和功能的良好,是一种值得推荐有效分离线粒体的方法。