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第一部分：CD40／CD40L在CD4+CIK细胞诱导肿瘤细胞凋亡中的作用研究目的：研究CD40／CD40L在CD4+CIK细胞诱导肿瘤细胞凋亡中的作用，并进一步探讨其相关机制。方法：体外大规模扩增CIK细胞，应用高强度磁珠分选系统纯化CD4+CIK细胞亚群，流式细胞法检测CD40L的表达，按照效靶比为1：1、5：1、10：1与MDA-MB-231细胞共孵育，流式细胞法检测按照不同效靶比共孵育24h后MDA-MB-231细胞表面Fas的表达以及凋亡变化；应用FasL、CD40L、IFN-γ中和性抗体分别阻断各自作用位点后比较MDA-MB-231细胞表面Fas的表达及凋亡变化；实时荧光定量RT-PCR检测CD4+CIK与MDA-MB-231细胞分别孵育4h、6h、24h后，MDA-MB-231细胞凋亡相关基因Bax、Bcl-2、FADD、FLIP的表达变化；实时荧光定量RT-PCR检测分别加入FasL、CD40L、IFN-γ中和性抗体后CD4+CIK与MDA-MB-231细胞共孵育24h，MDA-MB-231细胞凋亡相关基因Bax、Bcl-2、FADD、FLIP的表达变化。结果：经过多种细胞因子活化的CD4+CIK与MDA-MB-231细胞共孵育24h后，肿瘤细胞表面Fas表达由（4.6±0.23）％增加到（21.35±5.67）％，凋亡率由（1.6±0.42）％增加到（26.41±7.56）％，与对照组之间的差异有统计学意义，且随着效靶比的升高而增加（P＜0.01），同时Fas与凋亡之间存在正相关（r=0.618，P＜0.01）。加入FasL、CD40L、IFN-γ中和性抗体后凋亡率从（61.5±5.43）％分别降到（16.57±5.36）％、（20.63±6.37）％、（26.00±8.50）％，与对照组之间的差别有统计学意义（P＜0.01），Fas表达水平从（15.00±3.23）％分别降到（10.80±4.40）％、（6.93±1.56）％、（8.73±4.70）％，CD40L-Ab、IFN-γ-Ab引起的MDA-MB-231细胞表面Fas的降低，与对照组之间的差别有统计学意义（P＜0.05），其中CD40L在诱导肿瘤细胞凋亡中所起的作用较IFN-γ更强（P=0.003）。实时荧光定量RT-PCR结果显示：CD4+CIK与MDA-MB-231细胞共孵育6h后，Bcl-2由0.00141±0.0002降到0.00079±0.0001、FADD由0.02019±0.0049增到0.25678±0.0213、FLIP由0.0144±0.0026增到0.0591±0.0049，与对照组之间的差别有统计学意义（P＜0.05）；24h后，Bcl-2表达量增高到0.00236±0.00021，FADD降到0.01774±0.0022、FLIP降到0.0183±0.0013，与6h之间的差别有统计学意义（P＜0.01）。抗体封闭相应作用位点CD4+CIK作用于MDA-MB-231 24h后，实时荧光定量RT-PCR结果行线性回归分析的逐步分析法，结果显示：Bax、Bcl-2表达量的增高以及FADD表达量的降低与FasL相关；FasL提升Bax的作用明显，而去除FasL作用后可发现CD40L还有降低Bax的作用；Bax、Bcl-2表达量的降低、FLIP表达量的增高与IFN-γ相关。结论：1乳腺癌细胞系MDA-MB-231在CD4+CIK作用下，由Fas介导凋亡抵抗型转化为敏感型细胞。2 CD4+CIK可通过IFN-γ、CD40L的作用提升肿瘤细胞表面功能性Fas的表达，FasL与Fas交联进一步诱导肿瘤细胞凋亡，凋亡率与效应细胞数有明显依赖关系，并且CD40L在诱导肿瘤细胞凋亡中的作用较IFN-γ更强。3乳腺癌细胞系MDA-MB-231的凋亡信号通路被CD4+CIK活化，呈现FasⅡ型细胞的特点：共孵育6h MDA-MB-231细胞凋亡信号通路以FADD、FLIP升高为主，24h后DISC大量消耗，细胞内没有足够量DISC，凋亡信号通路表现为Bax、Bcl-2升高为主，通过线粒体通路诱导肿瘤细胞凋亡。4 CD40L除了有诱导肿瘤细胞凋亡的作用外，还可能通过其它机制减少Bax的表达抑制肿瘤细胞凋亡，起到保护作用。第二部分：稳定表达sCD40L的CHO细胞系的建立和鉴定目的：建立稳定表达sCD40L的CHO细胞系，进一步探讨CD40L在CD4+CIK细胞诱导肿瘤细胞凋亡中的生物学作用。方法：从含sCD40L的载体pDC316-sCD40L中，将sCD40L编码序列克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP，获得重组质粒pIRES2-EGFP-sCD40L，酶切及测序鉴定。电穿孔转染CHO细胞，G418筛选抗性克隆，有限稀释法获取单克隆后扩大培养，命名为CHO-sCD40L。流式细胞术、倒置荧光显微镜观察EGFP的表达。提取CHO-sCD40L细胞基因组DNA，PCR方法验证sCD40L基因是否整合入细胞基因组。提取细胞总RNA，并使用DNaseⅠ去除RNA中可能残留的基因组DNA，RT-PCR法检测sCD40L的mRNA，ELISA法检测sCD40L蛋白的表达。并将CHO-sCD40L与MDA-MB-231细胞共孵育，同时设置稳定表达pIRES2-EGEP的CHO细胞作为对照，流式细胞法比较24h后MDA-MB-231细胞表面分子Fas的表达变化；加入Fas激活性抗体（CH-11）后观察24h后MDA-MB-231细胞的凋亡。结果：成功构建质粒pIRES2-EGFP-sCD40L，转染CHO细胞后经克隆化培养获得三株稳定表达sCD40L的细胞系，分别命名为A12、G12、B11。流式细胞术、倒置荧光显微镜检测EGFP表达90％以上，PCR检测证实sCD40L基因整合入CHO-sCD40L细胞基因组DNA，RT-PCR检测到sCD40LmRNA的转录，ELISA法检测到细胞培养上清中有sCD40L蛋白表达，B11分泌量最高达到4.5±2.1ng／ml。选取B11与MDA-MB-231细胞共培养后，MDA-MB-231细胞表面分子Fas表达由（3±1.02）％升高到（34.8±8.75）％，加入CH-11 24h后凋亡率由（5.4±1.32）％提高到（20.7±5.24）％，与对照组之间的差异有统计学意义（P＜0.01）。结论：成功获得稳定表达sCD40L的CHO细胞系，为研究CD40／CD40L途径在肿瘤免疫治疗中的应用提供了有用的工具。CD40／CD40L的相互作用可提升MDA-MB-231细胞表面功能性Fas的表达，进一步可通过活化型Fas抗体诱导肿瘤细胞凋亡增加。