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中枢神经损伤后,如何提高神经元再生能力,促进轴突再生,恢复神经功能是世界一大医学难题。文献表明PI3K/PTEN/Akt/m TOR信号通路是调节中枢神经系统损伤后轴突再生的重要调节因子,对轴突的发生和延伸都有重要作用,但其作用机制不清。我们致力于寻找其下游与轴突再生相关的靶点。前期研究发现,CD44是m TOR调节轴突再生与生长锥形成的下游关键分子,查阅文献发现CD44与Src具有相关性,CD44沉默可以降低Src活性,且CD44沉默导致的树突形态的改变可因Src激活而恢复。基于以上背景,我们推测m TOR可能通过CD44调节Src活性进而促进损伤神经元生长锥形成及突起的生长。本研究选用SD大鼠乳鼠皮层神经元作为体外神经元模型。设计PTENsh RNA,CD44 sh RNA,PTEN+CD44 sh RNA沉默质粒,干扰神经元PTEN及CD44的表达。应用形态学与分子生物学技术阐明m TOR是否通过CD44活化Src促进损伤神经元生长锥形成及突起的生长。方法:原代培养SD大鼠乳鼠皮层神经元,首先采用PTEN sh RNA,CD44 sh RNA,PTEN+CD44 sh RNA干扰质粒转染皮层神经元,应用RT-PCR技术检测PTEN、CD44和Src m RNA表达的变化;应用Western blot技术检测PTEN,m TOR,CD44,Src蛋白水平的变化;其次在PTENi沉默后加入Src活性有效抑制剂(PP2),观察p Src蛋白水平的变化,明确体外培养的皮层神经元细胞中m TOR是否通过CD44调节Src活性。应用MTT法确定过氧化氢浓度,建立神经元氧化应激损伤模型。p Src免疫荧光染色观察PTENi组、PTENi+PP2组、PTENi+CD44i组损伤神经元p Src的表达。利用Phalloidin(鬼笔环肽)特异性染色标记肌动蛋白(F-actin),观察PTENi、PTENi+PP2、PTENi+CD44i干扰后损伤神经元生长锥及突起变化,以证明m TOR是否通过CD44活化Src,进而促进损伤神经元生长锥形成及突起的生长。结果:神经元生长3d时,转染PTENsh RNA,CD44sh RNA,PTEN+CD44sh RNA基因干扰质粒,筛选有效的干扰序列;运用RT-PCR和Western blot技术显示,PTENi沉默时,CD44,Src表达水平升高(P<0.001);CD44i沉默时,CD44,Src表达水平均降低(P<0.001);PTENi+CD44i双干扰时,m TOR表达水平升高,而PTEN,CD44,Src表达水平均降低(P<0.001);PTENi组激活p Src,PTENi+PP2组和PTENi+CD44i组p Src活性与PTENi组相比显著降低(P<0.001)。MTT法显示,200μM过氧化氢时,细胞存活率为60%,可以用于构建氧化应激模型。p Src免疫荧光染色显示,损伤神经元PTENi组,p Src在细胞内和生长锥末端表达较高,而sh NC组,PTENi+PP2组,PTENi+CD44i组p Src在细胞内(P<0.01)和生长锥末端表达较少(P<0.05)。F-actin标记的生长锥和突起统计学分析显示,损伤神经元PTENi组生长锥数目,面积和初级突起数明显高于sh NC组,PTENi+PP2组,PTENi+CD44i组(P<0.05)。同时,Sholl分析显示,PTENi沉默,显著提高损伤神经元突起复杂程度(P<0.001);损伤神经元PTENi组突起总长度和轴突长度明显高于sh NC组、PTENi+PP2组、PTENi+CD44i组(P<0.01)。结论:mTOR通过CD44活化Src,进而促进损伤神经元生长锥形成及突起的生长。