研究背景肺癌是最常见的致死性恶性肿瘤,肺癌中约80–85%的病理类型是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC),包括鳞状细胞癌,腺癌和大细胞癌等。早在19世纪末,Virchow等人便提出恶性肿瘤与炎症之间存在着密切关系。越来越多的证据表明,肿瘤相关炎性细胞和细胞因子一方面能够引起有效的宿主抗肿瘤反应,另一方面也会通过促进血管新生和肿瘤细胞迁移、营造免疫抑制微环境等机制促进肿瘤的发生发展和组织浸润。NSCLC是一种高免疫原性的肿瘤,其肿瘤微环境包含多种免疫细胞,包括肿瘤浸润性淋巴细胞、肿瘤相关性巨噬细胞、肿瘤相关性中性粒细胞等。这些肿瘤浸润性免疫细胞在肿瘤的发生发展、预后以及治疗中发挥着巨大作用。固有淋巴细胞(innate lymphoid cells,ILCs)是新近发现的一类区别于B细胞和T细胞隶属固有免疫系统的特殊淋巴细胞。ILCs能促成多种免疫途径,包括维持组织微环境稳态,增强适用性免疫,调节组织炎症,以及介导组织重塑。另外,ILCs的生物学范围也从经典的免疫学扩展到了肿瘤免疫的领域。越来越多的研究表明,肿瘤发生发展过程中,ILCs起着重要作用,但在不同肿瘤中的特征和作用并不相同,甚至相互矛盾。一是因为不同的肿瘤免疫微环境存在着巨大差异,二是因为ILCs是一个高度异质性细胞群,其中包含多种细胞亚型。ILCs中存在CD103阳性亚群,即CD103~+ILCs。普遍认为,CD103~+T淋巴细胞与恶性肿瘤的发生发展和肿瘤免疫密切相关,较高数量的肿瘤浸润性CD103~+T淋巴细胞是肿瘤预后的有益因素。但是,目前尚无研究报道CD103~+ILCs在人肿瘤组织中的特点和表现。本研究中,我们将探究CD103~+ILCs在人NSCLC免疫微环境中的特征以及CD103~+ILCs频率与患者临床和病理特征的相关性。研究方法经浙江大学医学院附属第二医院伦理委员会同意,本研究收集了浙江大学附属第二医院胸外科自2018年11月至2019年12月手术切除并经医院病理切片证实为非小细胞肺癌的新鲜肿瘤组织、配对正常组织51例,外周血15例。首先,将原代NSCLC肿瘤组织、配对正常肺组织以及外周血单个核细胞进行分离制成单细胞悬液后,利用流式细胞技术检测NSCLC患者肿瘤/正常组织和外周血中ILCs表达CD103的情况,分析CD103~+ILCs占总CD45~+淋巴细胞以及总ILCs的比例。之后,我们利用多色流式细胞检测技术探究了CD103~+ILCs和CD103~-ILCs细胞PD-1等免疫检查分子的表达水平、细胞表型以及细胞因子分泌等的特征。同时,通过特异性转录因子和细胞表面分子测定,鉴定CD103~+ILCs和CD103~-ILCs的细胞分群类型。最后,收集NSCLC患者的临床特征和病理情况,包括患者年龄、性别、吸烟史、肿瘤位置、肿瘤大小、邻近组织器官侵犯、远处转移和TNM分期等,分析肿瘤浸润性CD103~+ILCs的频率与这些临床、病理特征的相关性。研究结果1. CD103~+ILCs在人非小细胞肺癌中的鉴定和特征(1)NSCLC肿瘤组织中ILCs相比配对正常组织数量有所减少,但CD103~+ILCs的频率明显上升(17%vs 5.2%,p<0.0001),而外周血ILCs不表达CD103。另外,CD103~+ILCs高表达PD-1。(2)通过转录因子和特异性表面分子的检测,我们发现NSCLC浸润性CD103~+ILCs低表达转录因子T-bet和emose;而CD103~-ILCs显著高表达(>50%)转录因子T-bet,但低表达转录因子emose;两者均不表达CRTH2。显示CD103~+ILCs主要以3型ILCs为主,而CD103~-ILCs主要为ILC1s。(3)就细胞表型而言,我们发现:1)肿瘤浸润性CD103~+ILCs相比正常组织来源CD103~+ILCs表达更高水平的活化诱导分子CD69、细胞毒性受体NKP46以及共刺激分子ICOS;显著低表达CD117、CD57以及趋化因子受体CCR5。而其它如CD127、CD56,驱化因子受体CXCR4、CCR6,自然毒性相关受体NKP30、NKP44、CD94、KLRG1、CD158D、CD159A、CD159D,以及Toll样受体TLR2在CD103~+ILCs上均有不同程度的表达,但其肿瘤浸润性CD103~+ILCs和正常组织来源CD103~+ILCs上的表达没有差异;2)肿瘤浸润性CD103~-ILCs相比正常组织来源CD103~-ILCs表达更高水平的CD69、CXCR4、CD127、ICOS;显著低表达CD56和CD57。而其它如CCR5、CCR6、NKP30、NKP44、NKP46、CD94、CD117、TLR2、KLRG1、CD158D、CD159A和CD159C在CD103~-ILCs上也有不同程度的表达,但在肿瘤组织和正常组织中的表达没有差异;3)肿瘤浸润性CD103~+ILCs相比CD103~-ILCs表达更高水平的CD69、CCR5、ICOS、CD159A和NKP46;显著低表达KLRG1、CD158D、TLR2以及CD57。此外,我们也检测了CCR3、CXCR5、CXCR6、CXCR7、TLR1、TLR4、TLR6、CD161、TRAIL以及CRTH2,结果显示这些表面分子在肿瘤组织和正常肺组织中的CD103~+ILCs和CD103~-ILCs上都没有明显表达。(4)我们发现颗粒酶B是最主要分泌的毒性细胞因子。但肿瘤浸润性CD103~+ILCs和CD103~-ILCs较正常肺组织来源的CD103~+ILCs和CD103~-ILCs颗粒酶B的分泌明显减少;另一方面,CD103~-ILCs颗粒酶B的分泌能力显著高于CD103~+ILCs。此外,1)肿瘤浸润性CD103~+ILCs分泌较高水平穿孔素;IFNγ和TNFα的分泌水平也较高,但没有统计学意义;2)穿孔素、IFNγ和TNFα的分泌水平在肿瘤浸润性和正常组织来源的CD103~-ILCs中分泌没有显著差别;3)CD103~+ILCs较CD103~-ILCs分泌更高水平的IFNγ、穿孔素,而TNFα的分泌水平相似;4)TNFα和IFNγ,以及穿孔素和颗粒酶B在肿瘤组织和正常肺组织来源的CD103~+ILCs和CD103~-ILCs上的共表达情况没有显示出明显差异。(5)我们验证了肿瘤浸润性ILCs高表达CD103具有普适性。我们利用流式细胞技术检测了其它恶性肿瘤,包括SCLC和EC组织浸润性CD103~+ILCs频率的变化。结果发现,SCLC和EC肿瘤组织浸润性ILCs也明显高表达CD103,且表达量明显高于配对正常组织来源的CD103~+ILCs。2. 肿瘤浸润性CD103~+ILCs与NSCLC临床和病理特征相关性(1)我们测定了51例人NSCLC肿瘤组织中CD103~+ILCs的频率后,以中位数将其分成CD103~+ILCs高频率和低频率两组,并收集了对应患者的临床和病理数据。以卡方检验或Fisher确切概率法比较高频率和低频率组间的差异。结果显示吸烟情况和肿瘤位置与CD103~+ILCs频率明确相关:吸烟患者肿瘤组织中CD103~+ILCs频率明显高于不吸烟患者(p=0.029);右肺肿瘤含有更高频率的CD103~+ILCs(p=0.001)。其余如年龄、性别、既往恶性肿瘤病史和肿瘤家族史、血清肿瘤标志物水平与肿瘤浸润性CD103~+ILCs频率无明显关系。(2)就病理特征而言,我们发现鳞癌相比腺癌,肿瘤最大径>2cm相比肿瘤最大径≤2cm,有气道播散相比无气道播散,淋巴结转移阳性相比无淋巴结转移,高TNM分期(II+III+IV期)相比低TNM分期(I期),前者肿瘤组织中CD103~+ILCs的频率都较高,但差异并不显著。结论我们的研究首次发现在人NSCLC中,肿瘤浸润性CD103~+ILCs频率明显升高,并且这一现象在SCLC和EC中也同样存在。我们广泛比较了NSCLC肿瘤组织和正常组织来源CD103~+ILCs和CD103~-ILCs的免疫检查点分子表达、细胞表型(包括趋化因子受体、自然毒性相关受体、Toll样受体等)以及细胞因子分泌特征,证明了肿瘤浸润性CD103~+ILCs和CD103~-ILCs是具有独特表型和细胞因子分泌特征的ILC亚群,并在现有ILC分类体系下对CD103~+ILCs和CD103~-ILCs进行了分类,显示CD103~+ILCs以3型ILCs为主,CD103~-ILCs以ILC1s为主。进一步,我们发现NSCLC浸润性CD103~+ILCs频率与患者吸烟情况、肿瘤位置有关;与不良病理特征倾向于正相关,但差异不显著。