【摘 要】
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目的EGFR T790M突变所致吉非替尼耐药肺腺癌细胞的建立及ABT-737逆转耐药机制的细胞研究;EGFR T790M突变所致EGFR-TKIs耐药肺腺癌移植瘤裸鼠模型的建立及ABT-737逆转耐药机制的在体研究。方法利用对吉非替尼敏感的人肺腺癌细胞PC-9细胞株,应用大剂量吉非替尼冲击结合逐步递增浓度体外诱导法建立EGFR T790M突变所致继发性耐药的人肺腺癌细胞株（RPC-9）,以基因测序
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目的EGFR T790M突变所致吉非替尼耐药肺腺癌细胞的建立及ABT-737逆转耐药机制的细胞研究;EGFR T790M突变所致EGFR-TKIs耐药肺腺癌移植瘤裸鼠模型的建立及ABT-737逆转耐药机制的在体研究。方法利用对吉非替尼敏感的人肺腺癌细胞PC-9细胞株,应用大剂量吉非替尼冲击结合逐步递增浓度体外诱导法建立EGFR T790M突变所致继发性耐药的人肺腺癌细胞株（RPC-9）,以基因测序法检测PC-9及RPC-9细胞株EGFR T790M突变,用MTT法和FCM法检测不同浓度ABT-737联合吉非替尼对RPC-9细胞的增殖和凋亡的影响,用RT-PCR检测细胞内Bim、Bak、Caspase-3 mRNA表达水平。将RPC-9细胞悬液0.3ml（3×106/只）注射入每只BALB/C SPF雄性裸鼠右侧肩背部,当瘤体80 mm3时,随机分为4组,每组7只,分别为Ⅰ组空白对照、Ⅱ组吉非替尼、Ⅲ组ABT-737、Ⅳ组ABT-737+吉非替尼。每3日灌胃（22.2mg/kg）给药一次,并计算各组荷瘤裸鼠移植瘤体积,共8次。末次灌胃干预后次日脱颈处死裸鼠,取出裸鼠体内移植瘤瘤体。对各组瘤体组织进行组织病理学检查,基因测序法检测,Real-time PCR分析Bim、Bak、Caspase-3 mRNA表达水平,免疫组织化学法分析Bim、Bak、Caspase-3蛋白表达水平。结果成功建立EGFR T790M突变所致继发性耐药的肺腺癌细胞（RPC-9）;MTT方法检测结果,ABT-737单独用药对RPC-9细胞有抑制作用,且呈ABT-737浓度依赖性,最大抑制率11.3±0.99%,差异有统计学意义（P＜0.05）;ABT-737浓度（0、0.5、1、2、4、8、16 μ mol/L）联合吉非替尼（始终为10μ mol/L）对细胞的抑制作用明显,且呈ABT-737浓度依赖性,差异有统计学意义（P＜0.05）,当ABT-737浓度达到4m mol/L时,对细胞的抑制作用为54.11±2.98%,增加ABT-737浓度时对细胞的抑制作用未见明显增加,差异无统计学意义（P＞0.05）。FCM法检测,ABT-737联合吉非替尼对RPC-9细胞促凋亡作用明显,且呈ABT-737浓度依赖性,与其他组比较差异有统计学意义（P＜0.05）,当ABT-737浓度达到4μ mol/L时,对细胞的凋亡作用为55.04±3.15%;RT-PCR法检测各组细胞中Bim、Bak及Caspase-3 mRNA表达,随着ABT-737浓度的升高Bim、Bak及Caspase-3表达量显著增加（P＜0.05）。人肺腺癌（RPC-9细胞）移植瘤裸鼠模型结果示:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组裸鼠灌胃第10天后开始出现活动下降、饮食减少等症状,瘤体呈渐进性生长,且Ⅱ、Ⅲ组裸鼠瘤体较Ⅰ组瘤体稍小（P＞0.05）,Ⅳ组裸鼠活动及饮食较Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组明显强,且瘤体明显要小（P＜0.05）,3只裸鼠瘤体较灌胃前变小;基因检测所有裸鼠瘤体组织均为继发性耐药的人肺腺癌细胞株（RPC-9）;各组瘤体组织病理显示均为腺癌;RT-PCR分析裸鼠瘤体组织Bim、Bak、Caspase-3 mRNA表达水平Ⅳ组较Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组显著增高（P＜0.05）;免疫组织化学法分析裸鼠瘤体组织Bim、Bak、Caspase-3蛋白表达水平显示Ⅰ组阴性,Ⅱ、Ⅲ组弱阳性,Ⅳ组强阳性（P＜0.05）。结论建立EGFR T790M突变所致吉非替尼耐药肺腺癌细胞（RPC-9）及稳定的人肺腺癌（RPC-9细胞）移植瘤裸鼠模型;通过细胞和在体实验,ABT-737联合吉非替尼对RPC-9作用后Bim、Bak、Caspase-3 mRNA表达和蛋白表达量显著增加,ABT-737能显著增强吉非替尼促细胞凋亡作用,使原先耐药的RPC-9细胞重新死亡。
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