犬钩虫抗凝血肽c2（Ancylostoma caninum anticoagulantpeptide c2，AcAPc2）是从吸血寄生虫——犬钩虫（Ancylostoma caninum）中分离出来的一种具有抑制组织因子-VⅡa复合物（fVⅡa／TF）的蛋白。它通过结合于fXa的催化活性中心以外的部位而进一步特异性抑制fVⅡa／TF复合物。由于fVⅡa／TF复合物在凝血级联反应中起关键作用，因此AcAPc2可有效地抑制凝血。AcAPc2首先是由Stanssens等利用分子克隆技术分离出来的，它由84个氨基酸组成。尽管已有报道表明AcAPc2已实现了在E.coli和酵母中表达，然而该重组蛋白与天然的AcAPc2氨基酸序列存在一定的差异，这在一定程度上会影响目的蛋白的空间结构，进而影响蛋白的功能。到目前为止，利用基因工程的方法表达与天然AcAPc2氨基酸序列相同的AcAPc2（r AcAPc2）尚无文献报道。蛋白质剪接（protein splicing）是在蛋白质内含肽（intein）的自我催化作用下从翻译后的蛋白质前体中切除蛋白质内含肽，同时两侧的蛋白质外显肽（extein）通过连接反应形成一个新的具有生物活性的蛋白质。intein对于蛋白质工程来说是一个功能强大的工具。Intein与ex-tein几乎没有序列同源性，天然的extein常常可以替换成外源的蛋白质而不影响intein的剪切活性。这一点是以intein作为融合蛋白进行蛋白质纯化的理论基础。IMPACT^TM-TWIN系统利用intein的自剪切实现了蛋白的纯化。利用这一系统可以得到与天然蛋白序列一致的重组蛋白质。本研究利用pTWIN1表达载体，根据AcAPc2蛋白的氨基酸序列设计引物，利用引物搭桥PCR的方法合成AcAPc2的全长cDNA序列，成功构建了AcAPc2原核表达载体pTWIN1-AcAPc2，实现了AcAPc2在大肠杆菌中的高效表达。利用pTWIN1载体的SSP dnaB intein的自剪切和CBD与几丁质的紧密结合，获得了具有抗凝活性的、与天然AcAPc2蛋白氨基酸序列一致的rAcAPc2蛋白。丝氨酸蛋白酶参与体内各种生命活动的调控，调节生物体内许多重要的生命过程。研究表明某些丝氨酸蛋白酶抑制剂对肿瘤细胞的增殖有抑制作用，并且可以诱导某些肿瘤细胞的凋亡。作为丝氨酸蛋白酶抑制剂家族成员之一，AcAPC2可能会对肿瘤细胞的增殖具有抑制作用。本研究通过SRB染色法发现，rAcAPc2蛋白能剂量依赖性地抑制人肺癌细胞NCI-H460的体外增殖。在rAcAPc2浓度达到100μg／ml时，NCI-H460细胞生长抑制率达到69％。随后的DAPI染色、TUNEL和流式细胞术检测结果表明rAcAPc2能够诱导NCI-H460细胞发生凋亡。有资料显示uPA／uPAR在恶性肿瘤组织中的表达水平高于正常组织和良性肿瘤，其表达水平与患者的预后有关。因此，uPA／uPAR系统被认为在肿瘤的生长、侵袭、转移过程中具有重要作用。2006年，Subramanian et al．报道uPA／uPAR转录水平的下调可以直接诱导细胞凋亡。有鉴于此，我们采用RT-PCR的方法，检测经rAcAPc2蛋白处理的NCI-H460细胞（rAcAPc2⁺）的尿激酶型纤溶酶原激活剂（urokinase-type plasminogen activator，uPA）和尿激酶型纤溶酶原激活剂受体（urokinase-type plasminogen activator receptor，uPAR）的mRNA表达情况，结果显示：随着rAcAPc2剂量的增高，NCI-H460细胞uPA和uPAR的mRNA表达水平随之降低。已经证实，细胞内uPA蛋白合成增加主要是由基因转录水平引起的，转录因子NF-κB在uPA和uPAR基因表达调控中起重要作用，它可以增加uPA和uPAR的转录表达，从而促进肿瘤细胞侵袭转移。NF-κB参与肿瘤细胞的增殖和抗凋亡作用过程，这是以NF-κB的活化为前提的。活化的NF-κB可以上调一系列抗凋亡基因转录和表达，从而抑制肿瘤细胞凋亡。NF-κB的活化依赖于26S蛋白酶体的识别及其对IκBα蛋白的水解。为了进一步研究rAcAPc2蛋白诱导NCI-H460细胞凋亡的机制，我们采用Western blot方法，使用NF-κB、IκBα多克隆抗体分别对rAcAPc2处理组和非处理组的细胞核蛋白和胞质蛋白进行检测，结果显示随着rAcAPc2剂量的增高，NCI-H460细胞核中NF-κB蛋白量随之降低而胞质中IκBα蛋白量则随之升高。为了进一步验证rAcAPc2是否影响NF-κB的活化，我们采用免疫组化和免疫荧光的方法检测NF-κB在细胞中的分布情况，结果表明随着rAcAPc2剂量的增高，NCI-H460细胞核中NF-κB蛋白水平随之降低。随后的EMSA法对核蛋白的测定结果显示对照组中NF-kappa B结合活性较强，而rAcAPc2处理组中随着rAcAPc2剂量的增加，NF-kappa B结合活性呈降低趋势。我们还检测了NCI-H460细胞26S蛋白酶体在不同浓度rAcAPc2作用下的胰蛋白酶活性，结果显示25μg／ml rAcAPc2即可抑制细胞26S蛋白酶体的胰蛋白酶活性，且随着rAcAPc2剂量的增加，细胞26S蛋白酶体的胰蛋白酶活性显著降低。我们的实验结果表明，rAcAPC2蛋白通过抑制26S蛋白酶体活性抑制了IκBα蛋白的降解，进而抑制了NF-κB的活化。以上结果显示通过简单的蛋白表达纯化系统，可以得到高表达的rAcAPc2-CBD-intein融合蛋白。利用pH-依赖型的Ssp dnaB intein的剪切，可以直接纯化出纯度为98％rAcAPc2。重要的是，rAcAPc2具有延长血浆凝血酶原时间和活化的部分凝血活酶时间及抑制胰蛋白酶活性的功能，而且这种抗凝活性和抑制胰蛋白酶活性是呈剂量效应的。高纯度、高活性的rAcAPc2的获得，不仅为AcAPc2蛋白的功能研究提供研究对象，而且为血栓相关疾病的治疗提供新的药物。进一步的研究表明rAcAPc2蛋白可以抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡。其机制可能是rAcAPc2蛋白通过抑制26S蛋白酶体活性抑制了IκBα的降解，从而抑制NF-κB的活化，进而抑制了与肿瘤细胞生长、转移密切相关的uPA和uPAR的转录表达，最终导致细胞发生凋亡。以上发现提示AcAPc2蛋白在肿瘤治疗中具有潜在的应用价值，其具体机制尚需要进一步的研究。