论文部分内容阅读
第一部分TNNI3K基因心脏特异性敲除对小鼠心功能的影响与机制研究研究背景与目的:肌钙蛋白Ⅰ相互作用激酶（cardiac troponin I-interacting kinase,TNNI3K）基因在染色体的定位靠近心脏房室间隔缺损易患基因存在区域,提示其可能参与心脏的正常发育。既往研究结果显示,TNNI3K基因与心肌细胞分化、病毒性心肌炎、扩张型心肌病、心律失常等心血管疾病,以及肥胖与代谢性疾病等均密切相关。本课题基于TNNI3K基因在心脏特异高表达的特性,构建了 TNNI3K基因的心脏特异性敲除小鼠模型,探究该基因敲除对小鼠心脏结构和心功能的影响及作用机制,以期揭示TNNI3K基因作为心血管疾病潜在治疗靶点的理论基础和科学依据。研究方法:首先,我们通过C RISPR-Cas9技术构建TNNI3K基因心脏特异性敲除小鼠（Tnni3k-cKO）模型,雄性Tnni3kfl/fl（WT）小鼠作为对照组（n=24）,雄性（Tnni3k-cKO）作为实验组（n=24）,上述两组小鼠又分别按照不同月龄（1、2、6和10月龄）各分为四组,每组6只小鼠,各组小鼠均普通饮食饲喂。继之,我们在不同月龄小鼠中使用超声心动图来评估心功能;然后眼眶取血分离血清,采用ELISA方法检测心衰标志物心房利钠肽（atrial natriuretic peptide,ANP）和脑利钠肽（brain natriuretic peptide,BNP）;处死小鼠后,取心肌组织进行HE染色、麦胚凝集素（wheat germ agglutinin staining,WGA）染色、Masson染色、天狼星红染色、TUNEL染色和免疫荧光双重染色来评估小鼠心肌细胞截面积、心肌肥大、心肌纤维化、心肌细胞凋亡等病理改变,通过Western blot技术来检测凋亡相关的蛋白以及信号通路蛋白的表达。最后,培养新生大鼠心室肌细胞,分为对照组（正常培养）和TNNI3K抑制剂组（加入TNNI3K抑制剂GSK114）,通过Western blot检测活化caspase 3和磷酸化p38 MAPK的表达水平。研究结果:与对照组相比,Tnni3k-cKO小鼠在不同月龄（1、2、6和10）中,表现为心功能均显著下降,并且随着月龄的增加而逐渐恶化,包括收缩功能的指标射血分数（ejection fraction,EF）、缩短分数（fractional shortening,FS）及舒张功能的指标早期舒张流速峰值与峰值早期运动波值（the ratio of peak early filling velocity to mitral annular early diastolic velocity,E/e’）;Tnni3k-cKO 小鼠的血清 ANP 和 BNP 水平显著升高;病理染色结果显示,随着月龄增加,Tnni3k-cKO小鼠逐渐出现心脏增大、左心室腔进行性扩大和心室壁变薄、肌丝排列紊乱等病理改变;同时,Tnni3k-cKO小鼠心肌肥大、心肌纤维化及心肌细胞凋亡的程度逐渐加重;Western blot结果显示,Tnni3k--cKO小鼠心肌细胞凋亡相关蛋白活化caspase-3和磷酸化p38 MAPK表达升高;细胞实验结果显示p38 MAPK信号通路可能参与TNNI3K基因心脏特异性敲除引起的心肌细胞凋亡。结论:本研究结果显示TNNI3K基因心脏特异性敲除导致小鼠出现心肌肥大、心肌纤维化及心肌细胞凋亡增加,以及心功能障碍,其损伤严重程度随小鼠月龄增加而逐渐加重,该基因敲除导致的心肌细胞凋亡可能与p38MAPK信号通路有关。该研究提示,TNNI3K基因对于维持正常心脏的结构和心功能具有重要意义。第二部分匹伐他汀对动脉粥样硬化患者脂蛋白颗粒的影响研究背景与目的:动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）对人类健康产生严重危害,是引起全球范围内的心血管死亡的主要原因之一。血脂异常是动脉粥样硬化的独立危险因素。流行病学研究结果显示,降低低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol,LDL-C）能够减少主要的不良心血管事件（MACEs）,提高高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol,HDL-C）也是治疗动脉粥样硬化疾病的靶点。传统的血脂四项（甘油三酯、总胆固醇、LDL-C和HDL-C）对于预测动脉粥样硬化具有一定价值,但近年研究结果显示脂蛋白颗粒亚组分的分析能够更好的预测动脉粥样硬化性心血管疾病。小而密LDL（small dense low-density lipoprotein,sdLDL）比其大而轻（large buoyant low-density lipoprotein,IbLDL）能够产生更强的致动脉粥样硬化的效果。目前临床常用的一线降脂药物是他汀类药物,匹伐他汀因抗炎、抗氧化应激及改善内皮功能等作用而成为目前针对动脉粥样斑块治疗的关键药物。本研究旨在探讨匹伐他汀对AS患者脂蛋白颗粒的影响。研究方法:我们入选了 36例经冠脉造影检查的病患,AS患者给予匹伐他汀治疗分为治疗组（n=18）,健康受试者为对照组（n=18）。我们收集了关于基线的临床和实验室的相关检查资料,Lipoprint脂蛋白分类检测仪分别对LDL和HDL颗粒进行分类检测。采用Lipoprint System的方法将LDL颗粒分成7个亚型,即LDL1-7,并计算LDL积分;HDL颗粒分成10个亚型,小颗粒HDL是1-3亚型,中颗粒HDL是4-7亚型,大颗粒HDL是8-10亚型。匹伐他汀治疗8周后比较两组治疗前后脂蛋白颗粒的变化。研究结果:与治疗前相比,匹伐他汀治疗后LDL-C,总胆固醇（total Cholesterol,TC）,甘油三酯（triglyceride,TG）和载脂蛋白B（apolipoproteinB,ApoB）的浓度均显著降低（P＜0.05）,大颗粒、中等颗粒和小颗粒LDL-C的浓度及中等颗粒和小颗粒LDL的百分比也显著降低（P＜0.05）。同时,高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）浓度显著增加（P＜0.05）,ox-LDL浓度显著降低（P＜0.05）。结论:本研究结果显示匹伐他汀2 mg/d治疗8周可有效降低大颗粒、中等颗粒和小颗粒LDL-C的浓度及中等颗粒和小颗粒LDL的百分比,降低血浆ox-LDL水平。本研究结果表明匹伐他汀可通过改善脂蛋白颗粒亚型分布发挥其抗动脉粥样硬化作用,揭示了其降脂作用的新机制。