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miRNA是植物生长发育和生理调控的重要影响因子,逐渐成为培育优良籽粒大小和作物产量的新靶标。水稻籽粒灌浆速率对籽粒大小及营养物质的积累有较大影响。实验室前期研究结果表明,miR1432在水稻强弱势粒灌浆中时序性差异表达,本研究利用谷蛋白特异启动子Gt13a,构建了胚乳特异性过表达miR1432(OXmiR1432)和低表达miR1432(STTM1432)的转基因材料,通过对miR1432组织表达模式分析、转基因材料鉴定、籽粒表型分析及灌浆速率和灌浆参数的拟合等,初步得出miR1432负向调控水稻籽粒灌浆充实的结论。进一步通过生物信息学预测,烟草瞬时转染系统和5’RACE的实验手段,分析鉴定出miR1432直接调控的下游靶基因OsACOT。通过对OsACOT抗miR1432转基因材料表型鉴定,共表达基因分析及转基因植株籽粒中内源激素IAA和ABA含量的测定,结合miR1432转基因材料花后10天胚乳转录组测序数据分析,推测miR1432-OsACOT调控模式可能通过调控内源激素含量从而影响水稻籽粒灌浆充实,进而决定籽粒大小和产量高低。主要研究结果如下:1、为明确miR1432在水稻发育中的表达模式,本研究采用stem-loop qPCR及GUS染色的方法对miR1432在水稻发育的不同时期的表达模式进行分析,发现miR1432在根与籽粒中优先表达,且在籽粒中的表达量随着灌浆的进行逐渐提高。统计分析野生型及miR1432不同阳性转基因株系籽粒特征(粒长,粒宽,粒厚),STTM1432转基因植株籽粒显著增大,糙米千粒重较野生型增加18.88%-20.28%;而OXmiR1432转基因植株糙米千粒重下降的幅度为23.58%-25.47%。通过对不同转基因株系灌浆参数拟合发现,STTM1432植株的最大灌浆速率和平均灌浆速率都得到显著提高,而OXmiR1432转基因株系则显著降低,而穗部等农艺性状则没有显著差异。进一步大田实验结果表明,STTM1432转基因株系增产的幅度为13.2%-17.14%,而OXmiR1432转基因株系产量下调的幅度为17.94%-29.12%。以上结果表明miR1432负调控水稻的灌浆充实。2、利用生物信息学网站预测miR1432靶基因,结合miR1432不同转基因植株中预测靶基因的表达量筛选候选基因。通过烟草瞬时转染的方法验证miR1432靶基因,经过验证,一个编码硫酯酶家族蛋白的基因OsACOT(LOC_Os04g35590)初步认定为miR1432下游的靶基因。该靶基因进一步通过5’RACE的方法在水稻体内得到验证,并且发现miR1432与靶基因作用的位点在靶序列第16-17碱基之间。3、为研究OsACOT对水稻籽粒发育的影响,采用荧光定量PCR方法分析OsACOT在水稻发育过程中的表达模式表明,OsACOT与miR1432有着类似的表达模式,在根与籽粒发育中表达量也很高。通过构建抗miR1432切割但不改变氨基酸序列的OsACOT过表达载体(OXmACOT)确定OXmACOT可以互补STTM1432转基因植株的表型。进一步对OXmACOT阳性转基因株系籽粒统计结果表明,OXmACOT转基因株系籽粒千粒重较野生型增加的幅度为38.91%-46.69%。同时,拟合OXmACOT转基因株系灌浆参数发现,无论是灌浆期间的平均灌浆速率还是最大灌浆速率在OXmACOT转基因株系中都得到了显著水平的提高而未影响穗部其他性状,表明OsACOT正向调控水稻籽粒的灌浆充实。4、为进一步研究miR1432对下游基因调控网络的影响及其在水稻籽粒灌浆过程中的生理分子机制,本研究对野生型及miR1432不同转基因株系花后10天胚乳进行了转录组测序,采用qRT-PCR的方式对RNA-seq数据进行了验证,并对差异表达基因进行了GO注释富集分析。发现参与脂类代谢与运输、脂肪酸合成、内膜系统构建、蔗糖淀粉代谢及IAA和ABA合成及信号转导等生物过程的基因得到了显著的富集,且采用qRT-PCR的方式证明了差异基因在OXmACOT中的表达量得到了显著上调。5、为解析OsACOT在水稻籽粒灌浆充实中的功能,本研究借助共表达基因网络分析的方法,结合水稻胚乳发育的芯片数据初步推测OsACOT可能参与脂类生物合成、内膜系统的构建、植物激素信号等生物过程,这与miR1432转基因植株中差异基因的富集结果是一致的。采用GC-MS的方法测定了野生型和OXmACOT转基因植株籽粒中脂肪酸的含量。通过对不同链长脂肪酸的百分含量进行分析,表明OsACOT可能是参与中链脂肪酸尤其是C16:0到C18:2脂肪酸的合成过程中的关键酶。同时,无论IAA还是ABA的含量,在STTM1432和OXmACOT转基因株系中显著上调,而在OXmiR1432转基因株系中显著下调。上述结果表明,在miR1432-OsACOT模式通过影响IAA和ABA的含量对水稻灌浆充实发挥调控作用。