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[目的]本实验以CD44及ALDH1基因及其表达产物为研究对象,构建真核表达重组质粒pBudCE4.1-CD44-ALDH1、pBudCE4.1-CD44、pBudCE4.1-ALDH1,并分别转染MCF-7细胞,观察实验各组CD44及ALDH1基因和蛋白表达情况及活性并进行统计学分析,用于以CD44及ALDH1为基础的肿瘤靶向治疗研究,为进一步实验提供理论支持。[内容]本课题主要由两部分组成：本文第一部分通过RT-PCR方法检测三种肿瘤细胞系MCF-7、PC3、A542中CD44及ALDH1目的基因的表达情况,依据实验结果选取合适细胞作为克隆目的基因片段的来源,通过DNA重组技术构建真核表达重组质粒pBudCE4.1-CD44、PBudCE4.1-ALDH1、 pBudCE4.1-CD44-ALDH1,并通过PCR、酶切、基因测序方法验证重组质粒构建是否成功。本文第二部分通过重组质粒转染MCF-7细胞,并细胞分组A：空白对照组B：空质粒组C:pBudCE4.1-CD44转染组D:pBudCE4.1-ALDH1转染组E:pBudCE4.1-CD44-ALDH1转染组,应用RT-PCR及Western blot检测目的基因CD44及ALDH1的体外表达变化；应用CCK-8法检测目的基因CD44与ALDH1对细胞增殖能力影响,MTT法检测其对细胞-基质粘附能力的影响,并应用统计学方法分析。[方法]1. MCF-7、PC3、A542三种肿瘤细胞系培养,并应用RT-PCR检测三种细胞系中基因CD44及ALDH1的表达情况。2.依据上步检测结果选取MCF-7及A542细胞系作为外源基因克隆来源,应用RT-PCR获得目的基因：含Not1/XhoI酶切位点CD44转录子4及含HindⅢ/Xbal酶切位点ALDH1片段。3.利用DNA重组技术构建真核表达重组质粒pBudCE4.1-CD44-ALDH1、 pBudCE4.1-CD44. pBudCE4.1-ALDH1。4.转化大肠杆菌DHa5后取阳性克隆子培养并提取质粒,应用PCR、酶切、基因测序等方法鉴定重组质粒。5.上述重组质粒应用lp2000方法转染MCF-7细胞,并细胞分组A：空白对照组B：空质粒组C:pBudCE4.1-CD44转染组D:pBudCE4.1-ALDH1转染组E：pBudCE4.1-CD44-ALDH1转染组,应用RT-PCR及Western blot检测目的基因CD44及ALDH1的瞬时表达变化。6.应用CCK-8及MTT法检测目的基因CD44与ALDH1对细胞增殖能力及细胞-基质粘附能力的影响,并应用统计学方法分析。[结果]1.RT-PCR结果显示：CD44在MCF-7、PC3中表达,在A542中未见表达；ALDH1仅在A542细胞中微弱表达,在PC3、MCF-7细胞中未见表达。2.RT-PCR获取CD44转录子4及ALDH1基因片段。3.构建获得真核表达重组质粒pBudCE4.1-CD44-ALDH1、pBudCE4.1-CD44、 pBudCE4.1-ALDH1。4.经PCR、酶切、基因测序等方法鉴定重组质粒构建正确。5.各组重组质粒的体外表达及活性检测显示：RT-PCR及Western blot行半定量分析表明：CD44蛋白水平的表达,A、B组与D、E组间差异有统计学意义(P<0.05),C组与E组差异有统计学意义(P<0.05)；ALDH1蛋白水平的表达,A、B组与C、D、E组间差异有统计学意义(P<0.05),D组与E组差异有统计学意义(P<0.05)。6.细胞体外增殖实验显示：单基因转染组C组和D组细胞的增殖能力与A组、B组(未转染组细胞、空载体组)相比明显提高(P<0.05),同时双基因转染组E细胞的增殖能力较C组和D组细胞更进一步提高(P<0.05)。在粘附实验中,与A组和B组细胞相比,单基因转染组C组和D组细胞与基质的粘附能力均显著提高,差异具有统计学意义(P<0.05),运用双基因共表达载体进行转染后,E组肿瘤细胞的基质粘附能力得到显著提高,且提高较单基因转染组C组和D组细胞更为明显(P<0.05)。[结论]1.成功构建了真核表达重组质粒pBudCE4.1-CD44-ALDH1、pBudCE4.1-CD44、pBudCE4.1-ALDH1。2.CD44及ALDH1基因及其表达产物使肿瘤细胞体外增殖能力提高、肿瘤细胞-基质粘附性增加,在肿瘤细胞的发生发展中起重要作用。3.重组质粒pBudCE4.1-CD44-ALDH1、pBudCE4.1-CD44、pBudCE4.1-ALDH1用于多种肿瘤的基础研究,具有很好的前景。