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冠状病毒宿主广泛,成员众多。当前,新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的流行给全球公共健康带来了巨大挑战,也给全球经济造成了巨大损失,然而目前预防或治疗冠状病毒感染的手段仍然非常有限。冠状病毒“利用”和“劫持”宿主因子来调节细胞内环境实现高效复制。然而在冠状病毒生命周期中,相关的细胞宿主因子和参与的宿主信号通路仍未阐明,亟需进一步深入研究。CRISPR文库已被证明是筛选不同病毒（如SARS-CoV-2、甲型流感病毒（IAV）和日本脑炎病毒（JEV））感染所需的宿主因子的有力工具。本研究利用猪CRISPR/Cas9全基因组敲除文库高通量特异性的筛选猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）在PK-15细胞中复制所需的宿主因子,并聚焦于关键宿主因子TMEM41B展开深入研究:1.利用Genome-wide CRISPR/Cas9技术筛选与TGEV增殖相关的宿主候选因子以TGEV为模式病毒对猪全基因组敲除细胞库进行连续3轮感染（MOI=0.001）,收集存活细胞进行高通量测序。分析发现,在3轮CRISPR筛选中,已知的TGEV功能受体ANPEP均显著富集,这表明我们基于CRISPR文库筛选的TGEV感染相关的候选宿主因子策略是可行的。通过GO/KEGG分析,在富集到reads＞10,000的sg RNAs的靶基因中,主要涉及到的生物过程（Biological process）包括:转化生长因子受体信号、蛋白质水解、糖胺聚糖生物合成等过程。为了初步验证候选基因对TGEV复制的影响,对排名靠前的14个宿主因子（GRAMD1C、LPP、ARHGEF38、STK36、SEC24B、TRIM2、CMTM6、DYRK1A、AK8、PPP2R5D、TAX1BP1、VSIG2、BARHL2和RPSA）进行敲除验证,发现不同基因敲除的细胞系对于TGEV的复制具有不同程度的抑制效果。2.构建Focused-CRISPR文库,筛选并鉴定了参与TGEV复制的关键宿主因子TMEM41B为了进一步挖掘TGEV复制的关键宿主因子,我们从Pig Ge CKO的筛选中选取了79个排名靠前的候选宿主因子（不包括靶向ANPEP基因的sg RNA）,构建了Focused-CRISPR文库。在Focused-CRISPR文库筛选中,我们使用了更高的病毒滴度（MOI=1）来筛选具有更强抑制TGEV感染能力的敲除细胞。分析结果发现,第3轮和第5轮筛选中均存在4个靶向TMEM41B（Transmembrane protein 41B）的sg RNA。结合Genome-wide和Focused-CRISPR文库筛选结果,我们构建了TMEM41B、LPP、TAX1BP、BARHL2以及受体ANPEP这5种单克隆敲除细胞系。病毒毒价以及间接免疫荧光实验结果表明敲除这5种宿主因子均明显抑制TGEV的复制。其中,TGEV在TMEM41B敲除细胞系中复制滴度下降4个log10。3.TMEM41B在冠状病毒复制细胞器的形成过程中发挥重要作用转录组学分析及验证结果表明TMEM41B是一个免疫负调控因子,且该功能不参与TGEV的复制。共聚焦实验表明细胞内敲除TMEM41B抑制了病毒感染的内吞阶段,病毒粒子内化程度下降约30%。此外,TGEV在TMEM41B敲除细胞系中的早期复制阶段严重受损,TGEV复制的标志物-ds RNA无法在感染TGEV的TMEM41B敲除细胞系中正常形成。接下来,我们通过透射电子显微镜成像来评估TGEV在TMEM41B-KO细胞系中形成复制细胞器的能力。结果显示TGEV感染野生型细胞后可以检测到典型的双层囊泡（Double-membrane vesicles,DMVs）、双膜小球体（Double-membrane spherules,DMSs）和内质网膨胀形成的不规则卷曲膜等病毒复制细胞器。然而,感染TGEV的TMEM41B-KO细胞中则没有观察到类似的病毒复制细胞器结构。同时,我们利用SARS-CoV-2非结构蛋白诱导的DMVs模型来研究TMEM41B的功能,结果显示TMEM41B敲除细胞系中的内质网无法产生足够的形变来诱导DMVs的正常形成。这些结果表明TMEM41B在冠状病毒复制细胞器形成的过程中发挥了重要作用。4.TMEM41B是多种RNA病毒复制所需的宿主因子通过敲除和回补实验,我们发现TMEM41B不仅是冠状病毒TGEV、鼠肝炎病毒（MHV）和猪δ冠状病毒（PDCoV）的关键宿主因子,同时也是调控黄病毒JEV以及负链病毒水泡性口炎病毒VSV和IAV复制所需的重要宿主因子。5.TMEM41B是MHV在小鼠体内增殖的重要宿主因子为了评估TMEM41B对冠状病毒在体内感染的影响,由公司利用CRISPR/Cas9技术制备得到了基因敲除小鼠(TMEM41B+/-)。冠状病毒MHV感染小鼠模型数据显示,杂合敲除该因子可以显著抑制冠状病毒MHV的感染,并延缓了病程。实验表明与野生型（WT）小鼠肝脏相比,TMEM41B+/-小鼠肝脏中的病毒滴度显著降低。以上结果表明TMEM41B是冠状病毒MHV体内感染的重要宿主因子。综上所述,我们利用Genome-wide CRISPR/Cas9技术筛选并鉴定到了关键宿主因子TMEM41B,并系统的研究了TMEM41B在冠状病毒复制中可能的分子机制。动物实验结果首次证明了TMEM41B在与冠状病毒体内感染的相关性,提示TMEM41B是一种非常有前景的广谱抗冠状病毒治疗靶点。