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研究目的及意义:本次课题从体外实验角度对糖络宁治疗DPN的可能机制miR-200a及MAPKs信号通路进行验证与探索,以部分阐明中药糖络宁用于临床治疗糖尿病周围神经病变的可能作用机制。研究方法:1.清洁级雄性6-8周SD大鼠60只,按随机数字表分类法随机分为4组:高浓度糖络宁组(15只),中浓度糖络宁组(15只),低浓度糖络宁组(15只),正常组(15只),分别按糖络宁组方生药5 g/kg·d、2.5 g/kg·d、1.25 g/kg·d和等量蒸馏水灌胃;连续给药10天后制备含药血清和正常对照血清。从新生SD胎鼠取材制备背根神经元细胞(DRGn)。2.将DRGn细胞接种于96孔板,随机分为4组:正常组、50、75、100 mmol/L葡萄糖组,分别培养24、48 h后采用CCK-8法检测各个葡萄糖浓度对DRG细胞活性的影响,确定高糖培养最佳浓度及指标检测适宜时间点。3.将DRGn细胞接种于96孔板,随机分为6组:正常组、2.5%、5%、10%、20%、30%糖络宁含药血清组,分别培养24、48 h后采用CCK-8法检测各个糖络宁含药血清浓度对DRGn细胞活性的影响,确定糖络宁含药血清培养最佳浓度及指标检测适宜时间点。4.将DRGn细胞接种于6孔板,随机分为5组:正常组、高糖组、高浓度糖络宁组、中浓度糖络宁组、低浓度糖络宁组,培养24h后,采用qRT-PCR法检测miR-200a、Jun、Mapk8、Map3k8mRNA 表达量,采用 Western Blot 法检测 Jun、JNK、Map3k8 蛋白表达量,流式法检测细胞凋亡。研究结果:1.CCK-8检测结果:时间比较:24h相比,不同浓度葡萄糖各组,48h后大鼠DRGn细胞活性下降较24 h更低,各浓度葡萄糖组不同时间同浓度比较具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。与24h相比,10%糖络宁含药血清中大鼠DRGn细胞活性较48h相比明显下降,有统计学意义(P<0.01)。其他糖络宁含药血清组24 h与48 h相比均有下降,没有统计学意义(P>0.05)。组间比较:在同一时间点,随着高糖浓度的增加,DRGn细胞活性逐渐下降,各浓度葡萄糖组同时间不同浓度比较具有统计学意义(P<0.01)。作用24h后,随着糖络宁含药血清浓度的增加,大鼠DRGn细胞活性呈先高后低的趋势,在10%糖络宁含药血清浓度达到峰值,除5%与2.5%、20%糖络宁含药血清浓度组间比较没有意义(P>0.05),其余各组间比较均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。作用48 h后,整体趋势与24 h一致,在10%糖络宁含药血清浓度达峰,除5%与2.5%糖络宁含药血清浓度组间比较没有意义(P>0.05),其余各组间比较均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。分析不同浓度下的葡萄糖及糖络宁含药血清干预后的生长曲线,选定75 mmol/L葡萄糖浓度、10%糖络宁含药血清作为干预浓度,药物作用后的24 h为观察点。2.qPCR检测结果:与正常组相比,高糖组miR-200a、Jun、Map3k8、Mapk8mRNA值明显增高,有统计学意义(P<0.01)。与高糖组相比,糖络宁组各组miR-200a、Jun、Map3k8、Mapk8mRNA值明显降低,有统计学意义(P<0.01)。与中浓度糖络宁组相比,高浓度糖络宁组miR-200a、Jun、Map3k8、Mapk8 mRNA值明显升高,有统计学意义(P<0.01)。低浓度糖络宁组miR-200a、Jun、Mapk8mRNA值明显升高,有统计学意义(P<0.01)。3.Western Blot检测结果:与正常组相比,高糖组JNK1、c-JUN、Map3k8磷酸化蛋白表达及磷酸化水平明显增高,有统计学意义(P<0.01),Map3k8总蛋白水平明显增高,有统计学意义(P<0.01),JNK1、c-JUN总蛋白表达无明显变化(P>0.(05)。与高糖组相比,糖络宁组各组JNK1、c-JUN、Map3k8磷酸化蛋白表达及磷酸化水平明显降低,有统计学意义(P<0.01),总蛋白表达均无明显变化(P>0.05)。分别与高、低浓度糖络宁组相比,中浓度糖络宁组JNK1、c-JUN、Map3k8磷酸化蛋白表达及其磷酸化水平降低幅度更大,有统计学意义(P<0.01)。4.流式检测结果:与正常组相比,高糖组细胞凋亡率明显增高(P<0.01),有统计学意义;与高糖组相比,糖络宁组各组细胞凋亡率明显降低(P<0.01),有统计学意义;与低、高浓度糖络宁组相比,中浓度糖络宁组细胞凋亡率明显降低(P<0.01),有统计学意义。研究结论及意义:1.高糖刺激能抑制大鼠DRGn细胞的活性,糖络宁含药血清能明显改善高糖刺激对大鼠DRGn细胞活性抑制。2.高糖刺激能上调大鼠DRGn细胞中的miR-200a水平,激活MAPKs信号通路进而促进细胞凋亡,糖络宁含药血清,尤其是中浓度糖络宁含药血清能通过抑制miR-200a上调,抑制MAPKs信号通路,明显减少细胞凋亡水平。总的来说,糖络宁可能通过抑制miR-200a表达,影响其介导的MAPK信号通路,降低细胞凋亡水平,减少神经损伤,防治DPN的发生及进展。