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目的构建HIF-1α基因RNA干扰慢病毒载体,观察沉默HIF-1α基因后对胶质母细胞瘤U87细胞增殖、侵袭及转移能力的影响。为进一步研究脑胶质瘤细胞增殖、侵袭及转移机制以及基因治疗提供理论基础。方法(1)选定HIF-1α基因RNAi靶序列,合成靶序列DNA,退火形成双链DNA,与经XhoⅠ和HpaⅠ双酶切后的慢病毒载体pLentilox3.7(pLL3.7)连接;产生的pLL3.7 HIF-1α慢病毒载体转化大肠杆菌DH5α,抽取质粒后,用限制性内切酶XbaⅠ和NotⅠ进行酶切鉴定,然后进行测序鉴定;(2)用PHR、pVSVG和pLL3.7慢病毒载体共转染包装细胞293T细胞(磷酸钙转染法),包装产生慢病毒,将收集的病毒上清经高速离心浓缩后,按一定比例稀释,然后感染293T细胞,用流式细胞仪检测293T细胞GFP蛋白的表达水平,从而测定病毒滴度;(3)利用前期构建的HIF-1α基因的短发夹RNA (shRNA )沉默HIF-1α基因,构建HIF-1α-shRNA的慢病毒表达载体,在脂质体介导下转染人胶质母细胞瘤细胞U87;(4)采用RT-PCR和Western blot检测HIF-1α基因干扰效率,MTT法检测细胞生长增殖,迁移实验检测细胞的体外迁移能力,Transwell小室模型检测细胞的体外侵袭及转移能力。结果(1)酶切和测序证实,构建出HIF-1α-shRNA的慢病毒载体pLL3.7 HIF-1α;(2)包装慢病毒,测得离心的浓缩病毒悬液的滴度为2×108 TU/ml;(3)RT-PCR证实HIF-1α-shRNA的慢病毒载体干扰U87细胞,细胞HIF-1α的mRNA表达明显下调;(4)Western blot检测证实HIF-1α-shRNA的慢病毒载体干扰U87细胞,细胞HIF-1α的蛋白表达明显下调;(5) MTT比色法、Transwell小室侵袭实验显示转染重组质粒的实验组与对照组相比,细胞增殖、侵袭能力受到明显抑制差异显著(P<0.05)。结论1.体外成功构建了HIF-1α基因RNAi慢病毒载体。HIF-1αshRNA表达质粒能有效地抑制U87细胞株的HIF-1αmRNA及其蛋白的表达;2.下调HIF-1α基因的表达能有效抑制U87细胞的迁移、增殖及侵袭能力。提示HIF-1α基因有望成为胶质母细胞瘤靶向基因治疗的有效手段。