背景:缺血性脑血管病为临床常见病、多发病,其发病率高、死亡率高、致残率高,严重危害人类健康和生命。该病属祖国医学中的“中风”范畴。临床上缺血性脑血管病占整个脑卒中的70%～80%,脑血栓形成、脑栓塞等是造成脑梗死的直接原因。其中大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)所致的局灶脑缺血最为常见。因此,研究局灶脑缺血/再灌注损伤及再生修复机制十分重要。作为缺血的一种代偿反应,缺血后的修复很大程度上是神经与血管的再生。其中,血管再生显得非常重要。血管再生途径有血管发生( vasculogenesis )、血管新生(angiogenesis)。血管发生指血管内皮细胞来源于血管内皮干/祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs),是胚胎时血管生成的主要途径;血管新生指血管内皮细胞来源于受损组织周围血管内皮,以出芽方式生长,形成新的血管。EPCs的问世,使我们认识到血管再生的又一机制,更新了传统意义上的出生后血管生成、血管损伤修复理论,并为缺血性疾病的研究治疗提供了新的思路。即EPCs参与缺血后新生血管形成,血管发生与血管新生两种血管生成方式在血管修复过程中均起非常重要的作用。EPCs主要存在于骨髓,脑缺血后,脑内释放出的一些细胞因子正是调动骨髓EPCs归巢的条件之一。其中,具有代表性的促血管发生的细胞因子为SDF-1α。SDF-1α与特异受体CXCR4结合而发挥动员EPCs并归巢的作用。脑缺血后血管生成机制立即被启动,包括血管新生和血管发生,但机体的这种自身反应能力十分薄弱,尚不足以改善脑缺血后的血管网络重建以及组织灌流状态。通过体表穴位的有效刺激激活体内保护机制,是一种较为理想和有效的治疗脑缺血的非药物手段。电针在临床上也有广泛的应用,在治疗卒中后遗症中能有效改善神经功能缺损,促进神经功能恢复。本实验组既往研究显示,电针可上调血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素(Ang-1)、下调内皮抑素(Endostatin),促进脑缺血后血管新生。而VEGF对血管发生也有促进作用,局灶脑缺血/再灌注后,VEGF与SDF-1α可共同作用促进血管再生。基于上述理由,本研究将着重研究穴位电针、AMD3100(CXCR4阻断剂)干预下,局灶脑缺血/再灌注大鼠脑内SDF-1α/CXCR4轴及血管再生变化,初步探讨脑缺血后电针调动脑外成血管因素促进脑内血管发生的机制。目的:(1)探讨大鼠局灶脑缺血/再灌注后,电针及AMD3100干预下,SDF-1α与CXCR4的时空表达规律;(2)探讨大鼠局灶脑缺血/再灌注后,电针及AMD3100干预下,脑内缺血区血管再生情况;(3)探讨SDF-1α/CXCR4轴在脑缺血后脑内血管再生中的作用,以及血管发生在脑缺血后血管修复中的地位;(4)探讨电针促进局灶脑缺血/再灌注大鼠脑内血管发生的成血管机制。方法:雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠,分为对照组(NC组)、模型组(I/R组)、电针组(I/RE组)、药物组(I/RA组)、生理盐水组(I/RN组),通过线栓法制备大脑中动脉局灶脑缺血lh/再灌注模型(MCAO/R模型),并将模型组和电针组按局灶脑缺血lh再灌注ld、3d、7d、14d、21d分为5个亚组,每个亚组用于免疫组化和RT-PCR检测的大鼠各5只。I/RE组取大鼠双侧“合谷”(LI 4)穴作为刺激部位,用电针治疗仪作连续刺激,每次刺激时间为15min,每天1次,7d为一疗程。I/RA组和I/RN组选择再灌注7d为观察时相点,再灌注第1d至第4d,I/RA组大鼠以1.25mg/kg腹腔注射AMD3100,每日1次,最多4d。I/RN组注射等体积生理盐水。对照组、I/RA组和I/RN组各4只。通过HE染色来了解脑梗塞后脑组织的病理学变化。神经症状评分了解局灶脑缺血/再灌注后大鼠神经功能缺损情况。采用免疫组化法检测基质细胞衍生因子-1α(stromal cell-derived factor-1,SDF-1α)、SDF-1α特异受体CXCR4蛋白质表达,CD34标记血管内皮细胞并计数。逆转录聚合酶链反应法(reverse transcription- polymerase chain reaction,RT-PCR)检测I/RE组和I/R组大鼠脑缺血区SDF-1αmRNA表达。其中,模型组与电针组SDF-1αmRNA表达的比较只选择再灌注3d、7d、14d三个时间点。结果: 1.神经症状学评分电针可有效改善局灶脑缺血/再灌注大鼠神经功能缺损,促进神经功能恢复。再灌注2h、1d、3d,评分逐渐减少,I/R组与I/RE组比较差异无显著性(p>0.05);随着缺血再灌注时间延长,大鼠神经功能有所恢复,再灌注7d、14d时,两组对应时间点比较有显著差异(p<0.05)。2. SDF-1αmRNA半定量分析NC组右侧大脑皮质有少量SDF-1αmRNA表达。I/R组缺血区大脑皮质SDF-1αmRNA表达随再灌注时间延长呈单峰样增加,再灌注1d明显增加(P<0.01),再灌注7d达峰值(P<0.01),随后逐渐下降,但仍高于NC组(P<0.01)。再灌注3d、7d、14d,I/RE组较I/R组SDF-1αmRNA表达增高,再灌注3d、7d组间比较,差异具有显著性(P<0.01),再灌注14d比较,差异仍有统计学意义(P<0.05)。3.免疫组化结果分析(1) SDF-1α蛋白半定量分析NC组:脑内有少量SDF-1α蛋白表达,在大脑皮质、海马、脑室旁周围等处脑组织、血管周围可见着色较浅的黄染细胞。I/R组:缺血侧大脑皮质可见大量棕黄色细胞,双侧脑组织对比,缺血侧大脑半球较对侧脑组织着色明显加深。与NC组比较,缺血区大脑皮质SDF-1α蛋白表达在再灌注第1天开始增加,其后呈增高趋势(P<0.05),7d达峰值(P<0.01),21d时仍未回到NC组水平(P<0.01)。I/RE组:SDF-1α蛋白表达规律及部位同I/R组,I/RE组SDF-1α蛋白表达更加明显,再灌注3d表达明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);再灌注7d、14d、21d组间比较,差异具有显著性(P<0.01)。I/RA组:再灌注7d,与I/R组及I/RN组比较,SDF-1α蛋白表达增高,差异具有显著性(P<0.01),但与I/RE组比较,I/RA组SDF-1α蛋白表达较低,差异具有显著性(P<0.01)。(2)CXCR4阳性细胞计数NC组:大脑皮质区,单个胞膜黄染的细胞数量极其有限,部分切片中未见CXCR4阳性细胞,但少量血管腔周围可见浅黄色的CXCR4阳性表达。I/R组:缺血侧大脑皮质、海马、侧脑室旁可见大量细胞壁深染的棕黄色CXCR4阳性细胞。其阳性细胞数随再灌注时间延长呈单峰样增加趋势,表达高峰在再灌注7d。I/RE组:CXCR4阳性细胞表达规律及部位同I/R组,但阳性细胞计数增加更加明显,再灌注3d、7d,表达明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),再灌注14d,CXCR4阳性细胞计数有所下降,但与I/R组相应时间点比较,差异具有显著性(P<0.01)。I/RA组:再灌注7d,与I/R组及I/RN组比较,CXCR4阳性细胞表达增加,差异具有显著性(P<0.01),但与I/RE组比较,差异无统计学意义(P>0.05),表达部位同模型组。(3)微血管计数I/R组:缺血区大脑皮质可见成簇、条索状深棕色新生血管。再灌注1d、3d、7d、14d,微血管计数逐渐增加,14d达高峰,21d时稍有回落,但仍处于较高表达水平。I/RE组:微血管表达规律同I/R组,表达高峰仍在再灌注14d。与I/R组比较,I/RE组再灌注各时间点微血管计数增加更明显,再灌注3d、7d、14d、21d差异具有显著性(P<0.01)。I/RA组:再灌注7d,与I/R组比较,I/RA组微血管计数更高,差异具有统计学意义(P<0.05);与I/RE组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论(:1)电针可有效改善局灶脑缺血/再灌注大鼠神经功能缺损,显著促进再灌注中后期肢体功能恢复;(2)电针可促进局灶脑缺血/再灌注大鼠脑缺血区皮质SDF-1αmRNA表达;(3)电针可激活局灶性脑缺血/再灌注大鼠脑缺血区皮质SDF-1α/CXCR4轴;(4)电针可促进局灶脑缺血/再灌注大鼠脑缺血区皮质血管再生;(5)电针可能通过上调局灶性脑缺血/再灌注大鼠缺血区大脑皮质SDF-1αmRNA及蛋白质的表达而促进缺血区大脑皮质血管再生。