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GTFIIH(general transcriptional factor IIH)是一个集转录、细胞周期调控及DNA损伤修复三种功能于一身的蛋白复合物,由Gtf2h2基因编码的GTF2H2/p44等10个亚基组成。医学遗传学研究发现GTFIIH的某些组成亚基突变导致着色性干皮病、Cockayne综合征和毛发低硫营养不良等严重临床疾病。然而,GTFIIH对生殖系统有无调控作用尚不清楚。我们实验室前期利用ENU-诱导小鼠基因突变的正向遗传学方法在全基因组范围内筛选调控雌性生殖功能基因的研究发现Gtf2h2突变致雌鼠不孕。这为研究GTFIIH对生殖系统的调控作用提供了重要遗传学模型。利用该突变小鼠模型,本论文对GTF2H2调控卵母细胞发育的作用进行了细致研究,并对其作用机制进行了初步探讨。我们首先对Gtf2h2突变雌鼠的不孕表型进行了深入分析。超数排卵与IVF(in vitro fertilization)实验显示Gtf2h2突变雌鼠排卵正常,但其所排的卵母细胞很少能正常受精并且无法形成囊胚。免疫荧光显示突变雌鼠排出的卵母细胞大多出现纺锤体异常现象,很少正常成熟至第二次减数分裂中期(MII)。这些结果表明GTF2H2调控卵母细胞发育和减数分裂进程,进而影响卵母细胞质量。为此,我们对GTF2H2是否在卵母细胞特异表达以及其在卵母细胞不同成熟阶段的定位进行了研究。Real-time RT-PCR与Western blot检测发现:与其它主要组织及卵丘细胞和壁层颗粒细胞相比较,GTF2H2在卵母细胞内优势表达;与GV(Germinal vesicle)-期卵母细胞相比较,Gtf2h2 mRNA在卵母细胞成熟后以及受精后的1-细胞略有下降,2-细胞后至囊胚阶段又逐渐上升。免疫荧光显示GTF2H2在卵母细胞成熟过程中呈现特异的细胞内定位:GV期主要在核内;成熟后(GVBD、MI与MII期)与微管共定位。为进一步研究GTF2H2的细胞内定位,我们利用“In-Fusion”体系将Gtf2h2 ORF成功克隆至pCMV6-AC-3DDK和pCMV6-AN-mKate载体,在经体外转录并将Gtf2h2-3DDK的mRNA注射入卵母细胞后,我们发现融合蛋白能够顺利表达并呈现与GTF2H2一致的定位。免疫荧光与Western blot显示GTF2H2-3DDK和GTF2H2-mKate融合蛋白在转染后HEK293细胞内表达并在细胞核内特异定位。最后,我们对GTF2H2调控卵母细胞发育的分子机制进行了初步探讨。通过检测卵母细胞内的C-端结构域磷酸化的RNA聚合酶II(RNA-PolII-pCTD)表达以及转录活性连缀分析(transcriptional activity run-on assay),发现Gtf2h2突变鼠卵母细胞中的转录活性与正常鼠卵母细胞相比无明显差异。该结果表明,Gtf2h2突变不影响卵母细胞总体转录活性,提示可能通过其它途径调控卵母细胞发育。综上所述,GTF2H2是一个在卵母细胞中特异表达并对卵母细胞减数分裂和发育潜能具有重要调控功能的关键蛋白。GTF2H2不是通过调控转录活性而可能是通过其他途径调控卵母细胞发育进而影响卵母细胞质量的。