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研究目的以脑缺血再灌注损伤模型大鼠为研究对象,通过电针预处理大鼠的“百会”、“肾俞”及“三阴交”穴,观察电针预处理对脑缺血再灌注损伤模型大鼠的脑保护效应。应用TRPV1的抑制剂AMG-517及TRPV1的激动剂Capsicine,进一步探讨电针预处理发挥的脑保护效应与TRPV1的关系。研究方法1.将30只SD雄性大鼠按随机数字表分成正常组(Control)、假手术组(Sham)、模型组(MCAO),各组10只。运用改良的神经功能缺损评分评估大鼠的神经功能,判断脑缺血再灌注大鼠模型的效果及稳定性;采用TTC染色法观察大鼠脑梗死的体积,并鉴定该模型成功与否。2.将60只SD雄性大鼠按随机数字表分成正常组(Control)、假手术组(Sham)、模型组(MCAO)、电针预处理组(EA+MCAO),每组15只。神经功能缺损评分评估大鼠神经功能;TTC染色观察大鼠脑梗死体积并计算其百分比;HE染色观察海马神经元数目和形态;蛋白免疫印迹(Western Blot)检测大鼠海马组织TRPV1蛋白表达。3.将80只SD雄性大鼠按随机数字表分成模型组(MCAO)、电针预处理组(EA+MCAO)、电针预处理+抑制剂组(AMG-517+EA+MCAO)、电针预处理+激动剂组(Capsicine+EA+MCAO)。神经功能缺损评分评估大鼠神经功能;TTC染色观察大鼠脑梗死体积并计算其百分比;HE染色观察海马神经元数目和形态;ELISA法检测大鼠海马组织炎症因子IL-1β、TNF-a和氧化应激相关指标SOD、MDA、GSH的含量。Western Blot检测大鼠海马TRPV1、p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK蛋白的表达情况。研究结果1.模型评价(1)神经功能缺损评分显示:Control组和Sham组大鼠神经功能缺损评分均为0,未观察到神经行为学异常;MCAO组大鼠出现不同程度的神经功能损伤。(2)TTC染色发现MCAO组大鼠右侧缺血脑组织出现典型白色梗死灶,与大脑中动脉支配区域相符,视交叉前后梗死灶比较稳定。Control组及Sham组大鼠脑组织TTC染色未见明显异常。2.电针预处理“百会”、“肾俞”及“三阴交”穴对脑缺血再灌注损伤大鼠的脑保护作用(1)神经功能缺损评分显示:Control组及Sham组大鼠的神经功能缺损评分为0,未观察到神经行为学异常;MCAO组大鼠出现明显的神经功能缺损;与MCAO组相比,EA+MCAO组大鼠神经功能缺损明显减轻。(2)TTC染色结果显示:Control组及Sham组大鼠双侧脑组织呈鲜红色,结构完整,层次分明,未见缺血灶;MCAO组和EA+MCAO组大鼠右侧大脑中动脉供血区域,可见到边缘呈淡红色的白色梗死灶;与MCAO组比较,EA+MCAO组大鼠脑梗死体积明显减小。(3)HE染色结果显示:Control组及Sham组大鼠右侧海马CA3区神经元排列紧密,神经元形态完整,结构清晰,核膜完整,核仁清晰,着色浅。MCAO组大鼠脑组织梗死中心区染色变浅,海马神经元细胞间隙增宽,排列紊乱,数目减少,核固缩,核膜与周围分界不清,核仁变小,形态不规则,核染色明显加深。与MCAO组相比,EA+MCAO组大鼠右侧海马神经元排列较规整,结构较完整,胞体轻中度肿胀,存活的神经元较多。(4)Western Blot结果显示:与Sham组相比,MCAO组大鼠右侧海马组织TRPV1蛋白表达明显增高;与MCAO组相比,EA+MCAO组大鼠右侧海马组织TRPV1蛋白表达明显减少。3.电针预处理抗脑缺血再灌注损伤效应与TRPV1的关系(1)神经功能缺损评分显示:与MCAO组相比,EA+MCAO组大鼠神经功能缺损评分明显降低(P<0.05);与EA+MCAO组相比,AMG-517+EA+MCAO组大鼠的神经功能评分稍低,差异无统计学意义;与EA+MCAO组相比,Capsicine+EA+MCAO组大鼠的神经功能评分明显升高(P<0.05)。(2)TTC染色结果显示:经MCAO造模的四组大鼠脑组织均出现不同程度的脑梗死(染色呈白色区域),其中MCAO组大鼠脑梗死体积最大。与MCAO组比较,EA+MCAO组大鼠的脑梗死体积明显减少(P<0.05);与EA+MCAO组比较,AMG-517+EA+MCAO组大鼠的脑梗死体积明显减少(P<0.05),而Capsicine+EA+MCAO组大鼠脑梗死体积明显增加(P<0.05)。(3)HE染色结果显示:经MCAO造模的四组大鼠右侧海马神经元形态结构出现不同程度的损伤以及神经元数目出现不同程度的变化。其中MCAO组脑组织大鼠海马神经元损伤最严重;与MCAO组相比,EA+MCAO组大鼠海马神经元的损伤减轻;与EA+MCAO组相比,AMG-517+EA+MCAO组大鼠海马神经元损伤明显减轻,而Capsicine+EA+MCAO组大鼠海马神经元损伤明显加重。(4)炎症因子相关指标:与MCAO组比较,EA+MCAO组大鼠右侧海马组织TNF-a、IL-1β含量明显减少(P<0.05);与EA+MCAO组比较,AMG-517+EA+MCAO组大鼠右侧海马组织TNF-a含量减少(P<0.05);与EA+MCAO组比较,Capsicine+EA+MCAO组大鼠TNF-a、IL-1β含量明显增加(P<0.05,P<0.05)。(5)氧化应应激相关指标:与MCAO组比较,EA+MCAO组大鼠右侧海马组织MDA含量明显减少(P<0.05),GSH、SOD含量明显增多(P<0.01,P<0.01);与EA+MCAO组比较,AMG-517+EA+MCAO组大鼠右侧海马组织MAD含量减少(P<0.05),GSH、SOD含量增多(P<0.05,P<0.05);与EA+MCAO组比较,Capsicine+EA+MCAO组大鼠MDA含量明显增加(P<0.05),GSH、SOD含量明显减少(P<0.05,P<0.05)。(6)Western blot结果显示:与MCAO组相比,EA+MCAO组大鼠右侧海马组织TRPV1蛋白表达明显下调(P<0.05)、p-p38 MAPK/p38MAPK比值明显降低(P<0.05);与EA+MCAO组相比,AMG-517+EA+MCAO组大鼠右侧海马组织TRPV1蛋白表达明显下调(P<0.01)、p-p38 MAPK/p38 MAPK比值明显降低(P<0.05)。p-ERK/ERK及p-JNK/JNK在四组间的差异均无统计学意义。研究结论1.改良的Longa线栓法在血管内能有效阻塞大鼠大脑中动脉,造成大脑中动脉供血区域的梗塞并能引起神经功能障碍。模型制作可以复制且具有一定的稳定性。2.电针预处理“百会”、“肾俞”及“三阴交”穴,可明显降低大鼠神经功能缺损评分,减小脑缺血再灌注大鼠脑梗死体积,减轻神经元的损伤,发挥抗脑缺血再灌注损伤效应;同时,电针预处理可以抑制脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织TRPV1蛋白的表达。3.TRPV1参与了电针预处理抗脑缺血再灌注损伤效应。下调TRPV1的表达,抑制p38 MAPK的磷酸化,减轻氧化应激损伤,降低炎症反应,可能是电针预处理抗脑缺血再灌注损伤的作用机制之一。