研究背景:心肌纤维化(myocardial fibrosis,MF)是心肌重构的主要表现之一,伴随各型胶原比例失调以及排列紊乱。气体信号分子一氧化氮(nitric oxide,NO)是心血管系统中重要的神经体液因素,可使蛋白质发生巯基亚硝基化修饰而影响蛋白质的表达、生物活性以及分子间相互作用、亚细胞定位等,进而参与蛋白质的功能调控。C-Jun氨基末端激酶蛋白(C-Jun N-terminal kinase,JNK)是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路的一重要分支,可激活其下游活化蛋白-1(Activator protein-1,AP-1),影响细胞增殖、胶原合成、细胞基质黏附等,并在心肌重构过程中发挥重要作用。研究表明JNK1可发生巯基亚硝化修饰,但JNK1的巯基亚硝基化修饰是否参与心肌纤维化尚无报道。研究目的:本研究在整体动物和离体细胞水平阐明JNK1的巯基亚硝基化修饰参与到心肌纤维化中,并探讨其发生巯基亚硝基化修饰的具体位点及作用机制。研究方法和结果:动物水平:取8～10周龄C57BL/6J雄性健康小鼠随机行主动脉缩窄术(TAC组)和假手术(sham组),取12周龄SHR雄性健康大鼠与相同背景周龄的WKY大鼠,用Biotin-Switch的方法特异性检测JNK1巯基亚硝基化修饰水平及调控修饰发生的酶的表达情况,结果发现在心肌纤维化模型中,JNK1的巯基亚硝基化修饰水平明显增加,且仅iNOS表达明显增加,eNOS和nNOS表达水平与对照组相比无明显差异。取8～10周龄iNOS-/-雄性健康小鼠随机行TAC术和sham假手术,采用Biotin-Switch和免疫印迹的方法特异性检测JNK1巯基亚硝基化修饰水平及心肌纤维化指标的表达水平,结果发现iNOS-/-后,行TAC术后,JNK1的巯基亚硝基化修饰水平及心肌纤维化程度相比于sham组不再明显增加。细胞水平:SD乳大鼠原代心肌成纤维细胞给予血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ,100 nM,24h)处理,用Biotin-Switch的方法检测心肌成纤维细胞中JNK1的巯基亚硝基化修饰水平,发现给予Ang Ⅱ后修饰水平明显增加。然后构建JNK1半胱氨酸位点突变(MT)及野生型(WT)质粒,利用GPS-SNO 1.0软件对JNK1的氨基酸序列进行分析,筛选出了 JNK1最可能发生巯基亚硝基化修饰的位点是Cys116和Cys163,其次Cys137和Cys213也通过该软件筛选出可能会发生巯基亚硝基化修饰,因此将这四个突变位点的质粒和野生型质粒分别转染HEK293细胞检测发生巯基亚硝基化修饰修饰的位点,转染成纤维细胞系给予Ang Ⅱ处理检测纤维化指标的表达及下游AP-1的活性,结果表明Ang Ⅱ处理后,JNK1的第116位和第163位半胱氨酸(Cys116、Cys163)发生巯基亚硝基化修饰,并激活AP-1,进而促进心肌纤维化的发生。结论:综上所述,促纤维化因素TAC/SHR/AngII刺激等,可通过诱导iNOS的表达,使JNK1的Cys116和Cys163发生巯基亚硝基化修饰,增加AP-1的活性,促纤维化基因的表达,引起心肌纤维化。