论文部分内容阅读
蛋白质谷氨酰胺酶（EC 3.5.1.44,Protein-glutaminase,简称PG）可以水解蛋白质和一些小肽侧链的谷氨酰胺并生成蛋白质L-谷氨酸和氨,是一种新型的蛋白质脱酰胺酶,无蛋白酶活性和谷氨酰胺转氨酶活性,特异性好。PG通过脱酰胺作用可改善蛋白质功能性,例如溶解性,乳化性,起泡性及凝胶化性质,这在一些食用蛋白质中是理想的性质,提示该酶在食品工业中有较大应用前景。PG来源于解朊金黄杆菌（Chryseobacterium proteolyticum）,且野生菌株由于产酶量低难以工业化。另一方面通过常规选育来提高PG产量的方法没有方向性且过程漫长、工作量巨大,而采用基因工程手段拿到外源蛋白是一种高效手段,枯草芽孢杆菌表达系统是一个优选,但已有研究中PG在枯草芽孢杆菌中成功表达的很少,且活性极低。故本文主要目的是实现蛋白质谷氨酰胺酶在枯草芽孢杆菌中的有效表达,探究枯草芽孢杆菌产的PG的一些理化性质和生物学活性,为今后PG在枯草芽孢杆菌中进行高效表达打下基础。本文研究的主要内容有以下几点:1、PG作为一个外分泌酶,是以前体蛋白的形式表达的,包括21个氨基酸的信号肽、114个氨基酸的前肽和185个氨基酸的成熟酶。为使PG更适于在枯草芽孢杆菌中表达,对其密码子进行优化,分别构建了两类不同表达形式的外分泌表达载体:两个成熟酶表达载体pHT43-mpg、pCW-mpg及一个带前肽表达载体pHT43-pp,使它们均分别在枯草芽孢杆菌WB800N中表达。结果表明,在枯草芽孢杆菌表达系统中,只有pHT43-pp可以将目的蛋白以带前肽形式（pro-PG）有效表达,而成熟酶表达载体则不能将目的片段mPG成功表达,证明了两种方法相比PG带前肽表达形式的有效性。2、pro-PG本身无活性,需去掉前肽成为成熟mPG才具有酶活性。为解决pro-PG的酶活性问题,本文使用了胰蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶对pro-PG进行酶解加工。结果首先确定了胰蛋白酶消化pro-PG得到酶活的有效性,使用0.15 mg/mL-0.6mg/mL的胰蛋白酶消化pro-PG 0.5-3 h最高可产生1.048 U/mL的酶活。然后确定了碱性蛋白酶及中性蛋白酶对pro-PG的切割作用。诱导表达后的含pro-PG的发酵上清蛋白液分别添加0.30 mg/mL的碱性蛋白酶和0.30 mg/mL的中性蛋白酶消化0.5-3 h均可获得最高0.75 U/mL左右的酶活,证实pro-PG可由三种蛋白酶加工成熟具有活性。3、已确定枯草芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶和中性蛋白酶均可加工pro-PG成为具有酶活的mPG后,为解决pro-PG在枯草芽孢杆菌的自加工成熟问题,将重组质粒pHT43-pp转化至可以产较多蛋白酶的枯草芽孢杆菌168和DB403中,重组菌pHT43-pp/168和pHT43-pp/DB403在IPTG诱导发酵过程中均可以通过自身产的蛋白酶对pro-PG进行加工,发酵原液最终获得0.7 U/mL左右的酶活。4、为探究枯草芽孢杆菌产的PG的酶学性质,又构建表达了带His标签的pro-PG,用经胰蛋白酶消化后产生、镍柱纯化后的mPG-His样品进行了mPG-His的理化性质分析和生物学活性检测,mPG-His大小为约20 k Da,比酶活19.003 U/mg。mPG-His样品有较好的pH适应性和稳定性,较好地温度适应性和较差的温度稳定性。CBZ-Gln-Gly为底物时的Vmax为1.381μM（NH3）?min-1?mL-1,Km为2.983 mM;以干酪素为底物时的Vmax为0.637μM（NH3）?min-1?mL-1,km为4.593 mM。mPG-His可以作用多种蛋白底物,可将大豆蛋白、小麦蛋白、脱脂牛奶等脱酰胺。金属离子影响较明显的是Cu2+、Fe3+和Fe2+,它们对酶样品活性有很明显的抑制作用;Na+、Li+对酶活性有弱的稳定作用,Co2+对酶活有较好的稳定作用;Mg2+、Ca2+、Zn2+三种金属盐对mPG-His除了有稳定作用甚至有激活作用。综上,本文的主要贡献是实现了蛋白质谷氨酰胺酶在枯草芽孢杆菌中的表达,探索了pro-PG由外源蛋白酶加工的途径,解决了pro-PG在枯草芽孢杆菌表达时的自加工成熟问题,并制备了mPG-His样品探究了枯草芽孢杆菌产的PG的一些性质,为PG更好地应用在食品工业中做出重贡献。