本论文的研究内容主要包括两个部分:1)水稻T-DNA插入突变体siz1的分析和OsSIZ1基因的功能研究;2)水稻抗坏血酸过氧化物酶OsAPX2的克隆和功能分析。水稻是世界上重要的粮食作物之一,又是研究单子叶植物和禾本科植物的模式植物。水稻基因组测序工作圆满结束后,研究的主要任务就是解读基因组。突变体尤其是标签突变体无疑是研究基因功能的好材料,目前通过世界上很多国家科学家的努力已经建成了有相当规模的水稻突变体库,充分利用这些突变体资源来挖掘和鉴定基因的功能是当前很多研究人员在从事的工作,我们实验室也在这方面做了一些工作,并得到了一些有意义的结果。在对本实验室创制的水稻增强子捕获突变体库研究的过程中,我们从中选取了突变表型和T-DNA标签共分离的两个突变体进行基因功能的研究,主要研究内容和结果如下:1.水稻突变体siz1在MS培养基上生长一周后发现突变体的侧根与对照日本晴相比侧根稠密,该表型与T-DNA插入共分离,侧翼序列的分析表明T-DNA A正向插入在水稻第5染色体上的基因OSJNBb0079L11.3的第三内含子,与拟南芥的SUMO E3连接酶AtSIZ1在核苷酸序列的相似性达51.63%。Southern blot结果表明突变体中仅有一个拷贝的T-DNA插入,且无Tos17新的转座位点出现。对杂合突变植株后代的GUS染色结果表明该基因符合孟德尔规律,说明该基因为单基因。OsSIZ1基因的启动子驱动GUS基因在根、茎、叶、花和花粉等组织中表达,在花和根中的染色较其它组织更深,说明该基因在花和根中强烈表达。35S启动子驱动下的OsSIZ1和GFP融合表达载体的转基因烟草幼苗在激光共聚焦显微镜下观察,根细胞的细胞核和细胞外周发出强烈的绿色荧光。此外,我们的研究发现与日本晴相比,该突变体幼苗的地上部生长素含量低于日本晴,而根中生长素含量高于日本晴,外源生长激素IAA对突变体的主根和冠根有明显抑制作用。从野生型植株中获得该基因的全长cDNA发现有两种转录本,将两种转录本分别构建功能互补载体导入突变体中,将T0代转基因植株的后代T1种子用来鉴定根系表型恢复情况,发现在带有较长的转录本的转基因株系中有一个株系的根系发生表型分离,既有野生型也有突变型,这一结果与预期表型一致,说明通过引入野生型基因可以恢复突变表型,功能互补实验成功。同时为了比较该基因与拟南芥中的同源基因的差异,我们还把OsSIZ1基因导入拟南芥同源突变体siz1中,OsSIZ1基因的引入可以使植株矮小、长势弱的突变体的表型恢复到接近野生型植株,拟南芥功能互补实验结果初步证明了OsSIZ1基因与拟南芥中的同源基因AtSIZ1基因在功能上有相似之处。本研究结果为深入研究SUMO化在水稻生长发育过程中扮演的角色提供了有用的线索,同时也为研究单子叶与双子叶植物中SUMO化的异同提供了参考。2.水稻矮杆不育突变体apx2中T-DNA插在OsAPX2的第四内含子,OsAPX2基因的表达完全被抑制后,导致水稻花药生长畸形,花粉活力严重下降,植株不能结实。apx2突变体的侧翼序列扩增也仅扩增到一个T-DNA插入而没有Tos17的新位点,矮杆不育性状与T-DNA插入共分离,这些结果意味着该基因的突变可能是导致突变表型的原因,因此我们进行了功能互补实验。将OsAPX2基因导入纯合突变体后,T0代再生植株可以结实,植株高度恢复到接近野生型水稻的高度。OsAPX2基因的启动子驱动GUS基因在根、叶、茎节、叶舌、花和花药表达,说明抗坏血酸过氧化物酶APX2在水稻中广泛存在。OsAPX2基因和GFP融合表达后在转基因烟草根细胞的细胞质和细胞外周发出可见绿色荧光。对突变体、互补转基因植株和过量表达植株叶片进行组织化学染色(DAB和NBT),发现突变体中活性氧含量高于对照,而互补转基因植株中的活性氧含量与野生型一致,说明OsAPX2基因的突变导致水稻叶片活性氧含量升高,尤其是H2O2的含量升高。研究还发现植株体内过量表达OsAPX2并不能提高植物清除活性氧的能力,相反会造成胁迫,说明植物体内活性氧的产生与清除存在一个动态的、精妙的平衡,不容打破。研究结果表明OsAPX2确实在水稻中起到清除活性氧的作用,该基因的克隆为揭示抗坏血酸过氧化物酶与活性氧H2O2的清除之间的关系提供了更多直接的证据。