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根据本实验室提交的鸭乙型肝炎病毒(Duck hepatitis B virus, DHBV)CH4株(登录号EU429324)基因的序列信息以及GenBank上金黄色葡萄球菌核酸酶(登录号CP006630.1)的序列信息,设计DHBV衣壳蛋白(Cap)基因和金黄色葡萄球菌核酸酶(SNase)基因的特异性引物。以DHBV病料和金黄色葡萄球菌为模板,对DHBVCH4株Cap基因和金黄色葡萄球菌SNase基因进行PCR扩增。开展了以下研究：1.金黄色葡萄球菌核酸酶基因的原核表达及活性分析利用PCR方法对金黄色葡萄球菌核酸酶SNase基因进行扩增,将SNase基因连接至pGM-T载体并进行酶切鉴定及测序,回收目的基因并亚克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组表达质粒pET-32a(+)-SNase,转入大肠杆菌表达菌Rosetta, IPTG诱导表达,收集表达的核酸酶蛋白,同时利用TDA变色法检测该酶的生物学活性。结果表明：成功扩增了SNase基因,大小为468bp,与预期片段大小一致；进一步构建了重组原核表达质粒pET-32a(+)-SNase,转化至表达菌Rosetta,通过IPTG的诱导表达,重组原核表达质粒pET-32a(+)-SNase成功表达分子量大小约为35 KDa核酸酶蛋白；同时检测出表达的重组核酸酶蛋白具有核酸酶活性,为后续实验选择核酸酶作为抗病毒因子奠定了基础。2.鸭乙型肝炎病毒衣壳蛋白与金黄色葡萄球菌核酸酶融合蛋白在大肠杆菌中的表达、活性分析及其抗血清的制备根据实验室提交GenBank的DHBV CH4株(登录号EU429324)完整Cap基因序列和GenBank上金黄色葡萄球菌核酸酶(登录号CP006630.1)的序列,结合重叠延伸PCR原理分别设计引物。以实验室保存DHBV阳性血清提取DNA作为模板,扩增Cap基因,同时提取金黄色葡萄球菌基因组扩增SNase基因,利用融合PCR技术扩增Cap-SNase融合基因：连接到pGM-T载体上,经酶切和测序鉴定后,目的基因亚克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组原核表达质粒pET-32a(+)-Cap-SNase,转入表达菌Rosetta;为了提高融合蛋白表达量,对诱导条件(温度、IPTG浓度、时间)进行优化,经IPTG诱导表达,获的融合表达蛋白；表达重组融合Cap-SNase蛋白经Ni-NTA柱亲和层析纯化,用兔抗鸭乙型肝炎病毒衣壳蛋白多克隆抗体检测纯化的重组融合蛋白,并进一步将纯化的蛋白免疫昆明鼠,制备多克隆抗体；同时TDA变色法检测纯化的融合蛋白是否具有核酸酶蛋白的生物学活性。结果表明,成功扩增融合基因Cap-SNase,大小为1236bp,与预期片段大小一致；构建了重组表达质粒pET-32a(+)-Cap-SNase,转化至表达菌Rosetta,诱导表达蛋白,分子量大小约为60KDa；经过诱导条件的优化,最终确定了蛋白表达的最优条件为：在37℃C、IPTG诱导浓度为1.0 mmol/L条件下诱导6 h,蛋白表达量达到最高值。重组融合蛋白主要以包涵体的形式存在。亲和层析纯化蛋白条带单一,同时检测表达的融合蛋白仍然具有核酸酶的活性,进一步将纯化的融合蛋白免疫昆明鼠后,成功制备出其多克隆抗体,双向琼脂扩散实验检测抗体滴度为1：8。鸭乙型肝炎病毒衣壳蛋白和金黄色葡萄球菌核酸酶融合蛋白的成功表达且具有核酸酶活性为后续真核表达奠定了理论基础,同时制备的鼠多克隆抗体为后续实验提供了实验素材。3.DHBV衣壳蛋白靶向核酸酶真核表达系统的构建及瞬时表达选择15日龄鸭胚,提取鸭胚肝脏用于培养鸭胚肝细胞；构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Cap-SNase;转染鸭胚肝细胞,收集转染后48 h的鸭胚肝细胞,提取鸭胚肝细胞总RNA,用特异性引物反转录后进行PCR扩增,从核酸水平检测真核表达质粒的表达情况,同时提取鸭胚肝细胞蛋白从蛋白水平检测,通过Western blotting检测Cap-SNase融合蛋白表达情况；检测表达融合蛋白核酸酶的生物学活性。结果表明,成功培养了鸭胚肝细胞,成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1 (+)-Cap-SNase;真核表达质粒转染鸭胚肝细胞后,提取转染后鸭胚肝细胞总RNA,能够从核酸水平上检测到真核表达质粒表达转录产生的mRNA;用制备的鼠多克隆抗体作为一抗进行检测,通过Western blotting检测结果显示真核表达质粒在鸭胚肝细胞中成功表达,分子量大约为47 KDa；同时,融合蛋白仍然具有核酸酶的生物学活性。4.应用衣壳蛋白靶向灭活策略抗鸭乙型肝炎病毒感染初步研究根据实验室所构建的pMD18-T-PreS/S质粒,建立荧光定量PCR标准曲线,通过标准曲线计算未知样品中病毒的含量。在体外培养鸭胚肝细胞转染真核表达质粒pcDNA3.1 (+)-Cap-SNase,人工接种鸭乙型肝病毒,收集不同时间点的细胞上清,用于提取细胞上清病毒基因组,荧光定量检测不同时间点细胞上清中病毒的含量,同时设置PBS空对照组和空质粒pcDNA3.1(+)组。荧光定量数据通过SPSS20.0进行统计分析,结果表明：应用质粒pMD18-T-PreS/S质粒成功构建荧光定量PCR标准曲线；荧光定量数据分析结果显示不同实验组不同时间点细胞上清中DHBV含量均没有显著性差异(P>0.05)。