背景:血浆甘油三酯(TG)升高是冠心病的独立危险因素,引起高甘油三酯血症(HTG)常见原因包括高果糖饮食、急性期反应(APR)、代谢综合征(MS)等。降低TG可有效防止冠心病,目前可降低TG的降脂药物主要有:他汀类、贝特类和血脂康等。载脂蛋白A5(ApoA5)是新发现的载脂蛋白超家族成员,大量研究均证实,ApoA5可显著降低血浆TG。过氧化物酶体增殖物激活受体-α(PPARα)和肝X受体-α(LXRα)是调节ApoA5表达的两个关键核受体,其中,前者上调ApoA5表达,而后者下调ApoA5表达。然而,目前尚不清楚高果糖饮食、急性期反应以及代谢综合征诱导的HTG是否与ApoA5有关;也不知他汀类、贝特类或血脂康降低TG是否通过ApoA5而起作用。目的:明确高果糖饮食、急性期反应以及代谢综合征诱导的HTG是否与ApoA5有关,明确非诺贝特、阿托伐他汀和血脂康降TG作用是否与调节ApoA5有关,并探讨核受体PPARα和LXRα对ApoA5表达的调节作用。方法:一.果糖诱导性高甘油三血症的动物和体外实验40只健康雄性Sprague-Dawley大鼠,随机分为五组(n=8/组):(1)对照组:正常普通饮食喂养;(2)HTG组:10%果糖水喂养2周建立高HTG大鼠模型,并继续喂养4周;(3)贝特组:HTG大鼠建模后,加予非诺贝特(100 mg/kg/天)干预4周;(4)他汀组:HTG大鼠建模后,加予阿托伐他汀(10 mg/kg/天)干预4周;(5)联合组:HTG大鼠建模后,加予非诺贝特(100 mg/kg/天)和阿托伐他汀(10mg/kg/天)干预4周。分别在0周、2周及6周测定体重和空腹血脂。6周后取动物肝脏组织标本,采用免疫组化、逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)及免疫印迹(WB)测定肝脏ApoA5的基因和蛋白表达,同时采用RT-PCR和WB测定肝脏PPARα和LXRα的基因和蛋白表达。以HepG2细胞为模型,观察果糖、非诺贝特和阿托伐他汀干预后,细胞TG浓度变化,ApoA5、PPARα和LXRα表达的改变,并通过PPARα或LXRα的激动剂或抑制剂干预,揭示三者调控ApoA5表达的机制。二.急性期反应性高甘油三酯血症的临床、动物及体外实验(一)ACS临床试验入选228例ACS患者和232名健康者作为研究对象,抽血分离血浆,采用酶联免疫吸附检测(ELISA)测定ApoA5血浆浓度,同时测定血浆C-反应蛋白和血脂水平。(二)急性炎症动物和体外实验32只6周龄健康雌性C57BL/6鼠,随机分为4组(n=8/组):(1)对照组,普通饮食喂养;(2)炎症组,普通饮食喂养4周后,腹腔注射100μg脂多糖(LPS)以建立急性炎症模型;(3)他汀组:阿托伐他汀(10 mg/kg/天)干预4周后,腹腔注射LPS;(4)贝特组,非诺贝特(100 mg/kg/天)干预4周后,腹腔注射LPS。分别在实验第0周、第4周注射LPS前、以及注射LPS后测定空腹血脂和肿瘤坏死因子-α(TNFα)血浆水平。注射LPS后取动物肝脏组织标本,采用RT-PCR和WB测定肝脏ApoA5和PPARα的基因和蛋白表达。体外观察人重组TNFα对HepG2细胞TG及ApoA5和PPARα表达的影响,同时观察阿托伐他汀和非诺贝特对TNFα刺激下肝细胞ApoA5表达的影响及其机制。三.血脂康降低冠心病患者甘油三酯的机制研究(一)血脂康降脂临床试验入选60例稳定性冠心病患者,随机分为两组,即血脂康组和对照组,分别接受血脂康(600 mg/次,一天两次)和安慰剂治疗,疗程共6周。实验前和实验第6周,采用ELISA测定血浆ApoA5浓度,同时测定空腹血脂水平。(二)动物和细胞实验32只健康雄性Sprague-Dawley大鼠,随机分为四组(n=8/组):(1)对照组:正常普通饮食喂养;(2)高甘油三酯血脂(HTG)组:10%果糖水喂养2周建立HTG大鼠模型,并继续喂养4周;(3)血脂康低剂量(L-XZK)组,10%果糖水喂养2周建立HTG大鼠模型后,加予血脂康20 mg/kg/天进行药物干预,干预4周;(4)血脂康高剂量(H-XZK)组,建立HTG大鼠模型后,加予血脂康40 mg/kg/天进行药物干预,干预4周。分别在实验前(0周)、实验后2周及6周测定空腹血脂水平。分别采用RT-PCR和WB测定肝脏ApoA5、PPARα和LXRα的基因和蛋白表达。体外观察血脂康干预对HepG2细胞TG、以及ApoA5、PPARα和LXRα表达的影响及其机制。四.代谢综合征临床、动物及体外实验(一)代谢综合征临床试验入选340例代谢综合征(MS)患者和342名健康者作为研究对象,采用ELISA测定ApoA5血浆浓度,同时测定空腹血脂、血糖和胰岛素,计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)。(二)动物和细胞实验24只8周龄的健康雄性Sprague-Dawley大鼠,随机分为3组(n=8/组):(1)对照组:普通饮食;(2)MS组:高果糖饮食(含60%果糖),喂养7周;(3)贝特组:高果糖饮食加予非诺贝特100mg/kg/天,干预7周。分别在实验第0周和第7周测定空腹血脂和尾动脉血压,并通过高胰岛素正常血糖钳夹技术测定胰岛素敏感性。实验结束时,取动物肝脏组织标本,采用RT-PCR和WB测定肝脏ApoA5的基因和蛋白表达。通过高浓度胰岛素诱导HepG2细胞,构建胰岛素抵抗(IR)肝细胞模型,体外观察胰岛素抵抗状况下肝细胞的ApoA5表达和TG变化,探讨非诺贝特对IR状况下肝细胞ApoA5表达的影响及其机制。结果:一.果糖诱导性高甘油三酯血症动物和体外实验结果1.6周后,HTG组大鼠血浆TG显著升高,而药物治疗组TG均显著降低,降低程度依次为:他汀组＜贝特组＜联合组(P＜0.05);相反,HTG组大鼠ApoA5基因和蛋白表达显著降低,而药物治疗组ApoA5表达均显著升高,升高程度依次为:他汀组＜贝特组＜联合组(P＜0.05);与动物实验一致,果糖显著抑制HepG2细胞的ApoA5基因和蛋白表达、升高细胞TG,而药物干预可上调ApoA5表达,降低TG,且疗效显著程度依次为:他汀组＜贝特组＜联合组(P＜0.05)。2.HTG组大鼠肝脏PPARα基因表达显著下调,而药物治疗组PPARα基因表达显著升高,升高程度依次为:他汀组＜贝特组＜联合组(P＜0.05),但各组大鼠PPARα蛋白表达无显著差异;果糖显著抑制细胞PPARα基因和蛋白表达,而药物干预可上调PPARα基因和蛋白表达,且疗效显著程度依次为:他汀组＜贝特组＜联合组(P＜0.05)。3.HTG组和贝特组大鼠肝脏LXRα基因表达显著升高,而他汀组LXRα基因表达显著降低(P＜0.01),联合组LXRα基因表达与对照组无显著差异,但各组LXRα蛋白表达无显著差异;果糖和贝特均可上调LXRα基因和蛋白表达,而他汀抑制LXRα表达,联合组LXRα表达与对照组无显著差异。二.急性期反应性高甘油三血症临床、动物及体外实验结果1.与对照组比较,ACS患者ApoA5、TG和CRP显著升高(P＜0.05)。2.ACS患者血浆ApoA5与TG(r=0.642,P＜0.001)和CRP(r=0.594,p＜0.001)均呈显著正相关,且其TG与CRP(r=0.572,P＜0.01)显著正相关。3.多元Logistic分析显示ApoA5血浆水平可能是ACS保护因素(OR=0.82,95%CI 0.70-0.95,P=0.02)。4.注射LPS后,炎症组小鼠TG显著升高,而TC、HDL-C和LDL-C显著降低(P＜0.001);而他汀和贝特减轻了炎症引起的上述血脂变化幅度(P＜0.05)。5.注射LPS后,炎症组小鼠肝脏ApoA5基因和蛋白表达显著升高,而PPARα基因和蛋白表达显著下降(P＜0.01);同样,他汀和贝特减轻了炎症引起的ApoA5和PPARα表达变化幅度(P＜0.05)。6.TNFα刺激后,HepG2细胞TG显著升高(P＜0.001),而他汀和贝特可以改善TNFα引起的细胞TG升高(P＜0.05)。7.TNFα刺激可上调HepG2细胞ApoA5基因和蛋白表达,但却抑制PPARα基因和蛋白表达;相反,他汀和贝特一方面可减少TNFα引起的ApoA5表达上调,另一方面可逆转TNFα引起的PPARα表达下降P＜0.05)。三.血脂康降低冠心病患者甘油三酯的机制研究结果1.血脂康治疗后,冠心病患者血浆TG显著下降,而ApoA5显著升高;所有冠心病患者ApoA5和TG显著负相关(P＜0.001)。2.血脂康剂量依赖性升高大鼠肝脏ApoA5基因和蛋白表达,降低血浆TG;血脂康剂量依赖性升高大鼠肝脏PPARα基因表达,抑制LXRα基因表达(P＜0.05)。3.血脂康显著升高HepG2细胞的ApoA5基因和蛋白表达,降低细胞TG(P＜0.01);PPARα抑制剂或LXRα激动剂显著抑制血脂康上调ApoA5表达作用(P＜0.05)。四.代谢综合征临床、动物及体外实验1.与对照组比较,MS患者血浆ApoA5显著降低、TG显著升高,且二者显著负相关(P＜0.05);MS患者HOMA-IR显著升高,且与ApoA5显著负相关(P＜0.05)。2.多元Logistic分析显示ApoA5血浆水平可能是MS保护因素(OR=0.77,95%CI 0.64-0.92,P=0.04)。3.与对照组比较,MS大鼠胰岛素敏感性显著下降,而肝脏ApoA5基因和蛋白表达显著下降(P均＜0.05)。4.非诺贝特干预后,MS大鼠胰岛素敏感性明显增加,TG显著下降,而肝脏ApoA5基因和蛋白表达显著升高(P均＜0.05)。5.高浓度胰岛素诱导下,HepG2细胞ApoA5基因和蛋白表达显著下降,而TG显著升高;非诺贝特可有效逆转高浓度胰岛素所导致的细胞ApoA5表达下调,降低TG,但加入PPARα抑制剂后,非诺贝特的上述治疗作用丧失(P均＜0.05)。结论:1.果糖通过抑制PPARα并上调LXRα表达,抑制肝脏ApoA5表达,诱导HTG;非诺贝特和阿托伐他汀均通过上调ApoA5表达,治疗果糖诱导性HTG,且二者在ApoA5表达调控上存在机制互补性。2.急性期反应可升高血浆TG,此时ApoA5也显著升高,但可能是机体的一种代偿,与此时PPARα表达下调关系不大;非诺贝特和阿托伐他汀均能降低急性炎症所致TG升高,但该作用不完全通过ApoA5途径,而与二者抗炎作用有关。3.血脂康通过上调PPARα并抑制LXRα表达,升高ApoA5肝脏表达和血浆水平,降低TG。4.MS时,ApoA5肝脏表达和血浆水平降低,导致TG升高,增加MS风险;非诺贝特通过升高ApoA5、改善IR,降低MS大鼠血浆TG。