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高血压是全球范围内的重大公共卫生问题,具有较高的发病率和死亡率,也是心血管疾病(如中风,心肌梗塞和心力衰竭等)的主要致病因素。近年来高血压导致的终末期肾病受到广泛关注,大量研究表明肾脏纤维化在其病理生理过程中发挥关键作用。尽管越来越多的研究发现氧化应激、肾素-醛固酮-血管紧张素系统(RAAS)激活、慢性炎症和血管活性物质等促进高血压肾损伤导致的肾纤维化的发生发展,但其发病机制尚不十分清楚,且目前临床对治疗和逆转肾纤维化的方法十分有限。因此,进一步探究高血压肾损伤导致的肾纤维化的发病机制,对寻找新的有效靶点和高血压肾病的诊断和治疗具有非常重要的意义。近来的研究表明G蛋白偶联受体(GProtein-Coupled Receptors,GPCR)与肾纤维化密切相关。GPCR是组成基因组中最大和最多样化的蛋白质家族之一,由于其调控多种重要的生理功能,以及表达于细胞膜并具有明确的结合位点,使其成为了常见的药物治疗靶点,约占所有FDA批准药物的35%。但是,大部分GPCR的病理生理学功能仍不明确。GPR97属于孤儿粘附型GPCR家族,目前发现在心、肾和骨髓以及一些免疫细胞表面高表达。研究表明GPR97在免疫细胞的调节和炎症反应中发挥着重要作用。本课题组前期的研究发现,GPR97可以通过调节Sema3A信号通路对急性肾损伤起到重要调控作用,而GPR97在高血压引起的肾纤维化中的作用目前尚不清楚。因此,深入研究GPR97在高血压引起的肾纤维化发病过程中的作用,明确其配体,对寻找高血压肾病的潜在有效治疗靶点具有十分重要的临床意义。研究目的1.探究GPR97在高血压引起的肾损伤中的表达模式,明确GPR97是否参与高血压引起的肾损伤的发生发展。2.明确GPR97在高血压引起的肾损伤中的作用。3.探讨GPR97在高血压引起的肾纤维化中的分子机制。研究方法第一部分GPR97在两种高血压模型小鼠肾脏中的表达模式1.1两种高血压模型的构建DOCA(deoxycorticosterone acetate,DOC A)/salt 诱导的高血压:选取 12 周左右野生型(wild type,WT)的C57BL/6J雄性小鼠,单肾摘除,恢复一周后于肩胛皮下处植入DOCA缓释片(25mg/21天),同时将小鼠饮用水换成1%NaCl,饲养21天。AngⅡ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)高血压模型:选取12周龄雄性野生型C57BL/6J小鼠,将预先制好的AngⅡ缓释泵(1500ng/kg/min)植入小鼠背部的皮下,继续饲养28天。1.2 GPR97在两种不同高血压小鼠肾脏中的表达变化蛋白质免疫印迹法(Westernblot,WB)检测DOCA/salt和AngⅡ诱导的高血压小鼠肾脏中GPR97的蛋白水平变化。通过免疫免疫组化法(immunohistochemistry,IHC)进一步确定两种高血压小鼠肾脏中GPR97表达水平的变化。1.3 GPR97在小鼠肾小管的表达分布通过免疫荧光双标(immunoflourescence,IF)实验,对GPCR97和肾小管标记蛋白AQP1、calbindin D28k和AQP3进行荧光双染,观察GPR97在小鼠近曲小管、远曲小管和集合管中的表达水平。1.4高血压致病因子TGF-β和AngⅡ刺激下NRK-52E中GPR97的表达变化体外实验中,采用WB方法检测TGF-β(10ng/ml)和AngⅡ(10-6M)刺激下大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)中GPR97蛋白水平的变化。第二部分GPR97在DOCA/salt高血压小鼠肾损伤中的作用2.1 GPR97敲除小鼠的验证利用PCR将从鼠尾提取的DNA进行基因鉴定。同时通过基因芯片评估GPR97在小鼠中敲除效率。2.2 GPR97对小鼠血压的影响通过尾套法测量各组小鼠的收缩压(systolic blood pressure,SBP),舒张压(diastolic blood pressure,DBP)以及平均血压(mean blood pressure,MBP)并统计分析。2.3 GPR97对高血压小鼠肾功能的影响通过检测肾重体重比和小鼠蛋白尿水平评价GPR97缺失对高血压小鼠肾功能的影响,过碘酸雪夫氏(periodicacid Schiff,PAS)染色观察各组小鼠肾小球形态学损伤。2.4 GPR97对高血压引起的肾纤维化的影响利用Masson染色观察各组小鼠肾纤维化的病理特征。通过WB和IHC检测纤维化相关蛋白Collagen-1,Fibronectin,Slug,E-cadherin在不同处理组小鼠肾脏中的表达情况。2.5体外实验研究GPR97对NRK-52E细胞中纤维化相关蛋白的影响通过转染小干扰RNA(siRNA)对NRK-52E细胞中GPR97进行基因沉默。采用WB的方法来观察不同处理组NRK-52E细胞中纤维化相关蛋白Collagen-1,Collagen-3,Fibronectin 和 MMP-14 的表达变化。第三部分GPR97调控DOCA/salt诱导的高血压引起的肾纤维化的分子机制3.1 GPR97对纤维化相关通路Smad2的调控WB检测不同处理组小鼠肾脏中p-Smad2的表达情况,同时通过IF和WB的方法在NRK-52E细胞中进行验证。3.2 GPR97对Hippo/YAP信号通路的调控通过WB检测各组小鼠肾中Hippo信号通路关键分子YAP的表达水平,进一步在体外利用IF和WB验证NRK-52E中不同处理条件下YAP的表达变化情况。研究结果:第一部分GPR97在两种高血压模型小鼠肾脏中的表达模式1.1 GPR97在DOCA/salt高血压小鼠肾脏中的表达明显升高WB检测结果显示,同假手术对照组相比,GPR97的蛋白水平在DOCA/salt诱导的高血压小鼠的肾脏中明显升高,而在AngⅡ诱导的高血压小鼠肾脏中变化不明显。同时,免疫组化的结果与WB结果一致,DOCA/salt诱导的高血压小鼠肾脏中GPR97表达升高,AngⅡ诱导的高血压小鼠肾脏中GPR97无显著变化。1.2 GPR97在小鼠肾脏的近曲小管表达较丰富通过IF将GPR97与3种肾小管marker共定位,发现GPR97在小鼠肾脏的近曲小管表达较丰富。1.3体外实验中TGF-β刺激NRK-52E后GPR97的表达明显升高WB结果显示,TGF-β刺激后,NRK-52E中GPR97的蛋白水平明显升高,而在AngⅡ刺激下GPR97的蛋白水平变化不明显。第二部分GPR97在DOCA/salt高血压小鼠肾损伤中的作用2.1 GPR97敲除小鼠的验证通过PCR结果,确认并选取GPR97敲除成功的小鼠用于后续实验,芯片结果进一步验证了 GPR97的敲除效率。2.2 GPR97的缺失对小鼠的血压没有影响利用尾套法测量不同处理组小鼠的收缩压、舒张压以及平均血压,发现GPR97的缺失对小鼠的血压没有明显的影响。2.3 GPR97的缺失能够改善高血压小鼠的肾功能肾重体重比和蛋白尿的结果均初步表明敲除GPR97能够改善DOCA/salt诱导的高血压小鼠的肾功能损伤。PAS染色结果显示敲除GPR97能够降低DOCA/salt诱导的肾小球系膜增生。2.4敲除GPR97能够缓解高血压引起的肾纤维化Masson染色结果显示,GPR97的缺失能够明显改善DOCA/salt诱导的高血压小鼠的肾小管间质纤维化。WB和IHC的结果显示,敲除GPR97能明显恢复高血压引起的小鼠肾脏中纤维化相关蛋白表达水平的异常,进一步表明敲除GPR97能够缓解高血压引起的肾纤维化。2.5沉默GPR97改善TGF-β诱导的NRK-52E细胞中纤维化相关蛋白的异常表达WB实验证实利用siRNA转染实现了对NRK-52E细胞中GPR97的基因沉默。进一步发现,沉默GPR97能够明显抑制TGF-β刺激所引起的NRK-52E细胞中纤维化相关蛋白Collagen-1,Collagen-3,Fibronectin和MMP-14的表达水平的升高,提示其可能调控肾脏纤维化。第三部分GPR97调控DOCA/salt诱导的高血压引起的肾纤维化的分子机制3.1 GPR97促进Smad2的磷酸化体内实验中,WB实验结果显示GPR97的缺失显著下调高血压引起的肾脏中p-Smad2的升高。体外实验,在NRK-52E细胞中,IF和WB实验得到了与体内一致的结果,GPR97的缺失抑制TGF-β引起的p-Smad2的升高。3.2 GPR97正调控Hippo/YAP信号通路WB结果显示敲除GPR97可以显著改善高血压引起的小鼠肾脏中Hippo通路关键分子YAP蛋白水平的升高。同时,体外IF和WB实验同样验证了这一变化,敲除GPR97可以抑制TGF-β引起的YAP表达升高。结论与创新性1.本研究首次证实了 GPR97在DOCA/salt诱导的高血压模型小鼠的肾脏中表达明显升高。进一步的研究发现敲除GPR97能够改善DOCA/salt高血压小鼠的肾纤维化。2.本研究明确了敲除GPR97能够在高血压病理条件下抑制经典的纤维化相关蛋白的表达从而减弱肾纤维化的发生发展。在分子机制上,首次证明了Hippo信号通路是GPR97调节高血压引起的肾纤维化的关键途径之一。本研究为进一步开拓GPR97的生物学功能,为寻找高血压引起的肾纤维化新的治疗靶点提供了重要的实验基础及理论依据。