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茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)是一种危害严重的土传植物致病菌,它具有非常广泛的宿主范围,在世界各地都有分布。细菌群体感应调节在茄科雷尔氏菌致病中起着非常重要的作用。茄科雷尔氏菌的群体感应信号分子是3-羟基棕榈酸甲酯,是由该菌脂肪酸合成途径提供的前体,3-羟基棕榈酰ACP,经进一步反应而成。然而目前对茄科雷尔氏菌的脂肪酸合成的研究少有报道。为了解茄科雷尔氏菌脂肪酸合成与该菌信号分子合成的关系,寻找通过干扰该菌群体感应调节系统来防治青枯病的新的靶点,本研究首先通过体内和体外方法鉴定了五个3-酮基脂酰ACP合成酶同源蛋白RSFabF1,RSFabF2,RSFabF3,RSFabF4和RSFabB在茄科雷尔氏菌脂肪酸合成代谢中的功能。研究结果如下:
1)3-酮基脂酰ACP合成酶同源基因互补大肠杆菌突变株CY242 fabB(Ts)和CY244 fabB(Ts)fabF
将五个目的基因rsfabF1,rsfabF2,rsfabF3,rsfabF4和rsfabB分别克隆并构建pBAD24M系列质粒pMl(rsfabF1),pM2(rsfabF2),pM3(rsfabF3),pM4(rsfabF4)和pM5(rsfabB)。随后通过转化大肠杆菌CY242 fabS(Ts)温敏突变菌株和CY244fabB(Ts)fabF双突变菌株进行异体遗传互补分析。结果显示rsfabF1,rsfabF2,rsfabF3,rsfabF4和rsfabB均不能使CY242fabB(Ts)恢复生长。对于CY244突变株,只有rsfabF1能使其在有油酸添加的培养基上恢复生长,其余四个基因均没有此功能。表明在这五个基因中,只有rsfabF1编码的蛋白具有长链3-酮基脂酰ACP合成酶活性。
为了排除是由于RSFabF2,RSFabF3,RSFabF4和RSFabB酶活力太小而不能满足突变菌株生长需要的推测,进行了CY244无细胞抽提物的体外酶活性检测。通过以辛酰ACP为底物的酰基链延伸反应,证实只有CY244/pM1无细胞抽提物表现出3-酮基脂酰ACP合成酶的活性,能将底物辛酰ACP延伸,产生多两个碳原子的癸酰ACP或更长链的酰基ACP。[1-14C]乙酸钠标记菌体,薄层层析分析菌体的磷脂合成的研究,也同样证实了RSFabF1的3-酮基脂酰ACP合成酶活性。
2)3-酮基脂酰ACP合成酶同源蛋白体外研究
首先进行RSFabF1,RSFabF2,RSFabF3,RSFabF4和RSFabB(3-酮基脂酰ACP合成酶同源蛋白)及RSFabD,RSFabH,RSFabI,RSFabZ蛋白(用于茄科雷尔氏菌体外脂肪酸合成体系构建)的表达检测与纯化。分别构建pET28(b)系列质粒pE1(rsfabF1),pE2(rsfabF2),pE3(rsfabF3),pE4(rsfabF4),pE5(rsfabB),pED(rsfabD),pEH(rsfabH),pEI(rsfabI),pEZ(rsfabZ),并转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下进行了各表达蛋白的可溶性检测。检测发现,RSFabF1、RSFabD、RSFabH、RSFabI和RSFabZ均属于可溶性蛋白,并通过非变性的Ni-NTA琼脂糖亲和层析纯化到了蛋白;而RSFabF2,RSFabF3,RSFabF4和RSFabB均以包涵体形式存在于细胞破碎液不溶物中。最终采用变性纯化方式得到了相应的蛋白。
其次分别构建大肠杆菌体和茄科雷尔氏菌的体外脂肪酸合成反应,并进行RSFabF1蛋白的3-酮基脂酰ACP合成酶活性检测。研究结果表明RSFabF1在大肠杆菌体外脂肪酸合成反应体系中具有与EcFabB一样的延伸脂酰链的功能,具有长链3-酮基脂酰ACP合成酶功能。在茄科雷尔氏菌体外脂肪酸合成反应中,RSFabF1可以对不同链的脂酰ACP进行延伸,并受浅蓝菌素的抑制。
3)3-酮基脂酰ACP合成酶同源基因rsfabF2,rsfabF3,rsfabF4和rsfabB的突变分析
首先利用同源重组方式分别构建了四个插入型突变菌株RS-F2(fabF2::Gm),RS-F3(fabF3::Gm),RS-F4(fabF4::Gm)和RS-B(fabB::Gm)。各突变株在M63平板上均与野生菌GMI1000一样,能正常生长,只是生长代时比野生菌代时长,(野生菌GMI1000,151min:RS-F2,209min:RS-F3,208min;RS-F4,217min:RS-B,181min)。其次GC-MS分析RS-F2,RS-F3,RS-F4和RS-B突变株脂肪酸组成,数据表明RS-F2,RS-F3,RS-F4和RS-B突变株与野生菌GMI1000相比,各主要脂肪酸组分没有显著性差异。再次证明了RSFabF2,RSFabF3,RSFabF4及RSFabB无长链3-酮基脂酰ACP合成酶活性,不参与茄科雷尔氏菌的脂肪酸合成。
4)RSFabF1是茄科雷尔氏菌脂肪酸合成的必需蛋白
利用同源重组方法试图获得rsfabF1的插入突变菌株,但经过多次筛选均未成功,推测rsfabF1是茄科雷尔氏菌的必需基因。为了验证这一推测,本研究进行了条件突变菌株的筛选。首先构建了携带rsfabF1且受IPTG诱导控制的pV-F1Histag-Tc质粒。将pV-F1Histag-Tc质粒通过接合转移的方法导入一次重组菌株RSY-F1菌株中,得到菌株RSY-F11。经过筛选获得了条件突变株RS-F1。该菌株在M63平板上生长表型明显不同于野生菌GMI1000:当IPTG诱导时可以正常生长但生长稍弱,当没有IPTG诱导时生长受阻、停滞。同时GC-MS分析RS-F1的主要脂肪酸组成含量,实验数据表明RS-F1菌株的脂肪酸组成与野生菌差异显著。为进一步证实RSFabF1是茄科雷尔氏菌脂肪酸合成的必需蛋白,随后进行了[1-14C]乙酸钠标记的磷脂合成分析和Western blot分析中,结果发现:在IPTG诱导的条件下,pV-F1Histag-Te质粒上的RSFabF1蛋白表达,使得茄科雷尔氏菌突变株磷脂可以从头合成,但是当不添加IPTG时,RSFabF1不能表达,茄科雷尔氏菌突变株磷脂合成停止。
综合以上研究结果,最后得出的结论为rsfabF1是茄科雷尔氏菌必需基因,具有敲除致死性,这在革兰氏阴性菌中并不常见。同时证实RSFabF具有3-酮基脂酰ACP合成酶Ⅱ活性,影响茄科雷尔氏菌脂肪酸合成合成;RSFabB及RSFabF2、RSFabF3及RSFabF4均3-酮基脂酰ACP合成酶活性,不参与青枯菌脂肪酸合成。