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[目的]核酸适配体(Aptamer)是一类能特异性识别靶分子的单链DNA或RNA,可利用人工构建的随机单链寡核苷酸文库,通过SELEX技术筛选获得。SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment,指数富集的配体系统进化)是一种全新的组合化学技术。核酸适配体具有无免疫原性、性质稳定、可体外合成、成本低、高特异性等特性。因而成为肿瘤生物标记物筛选及分子靶向治疗关注的焦点。恶性黑色素瘤是高死亡率的恶性肿瘤,云南地区高发。侵袭转移是黑色素瘤患者主要致死原因。本研究利用cell-SELEX技术,以高侵袭性黑色素瘤细胞A2058为靶细胞,以期筛选出侵袭性恶性黑色素瘤相关的特异性核酸适配体,为转移性恶性黑色素瘤分子诊断和靶向治疗提供新的候选靶标。[方法]本研究以人高侵袭性恶性黑色素瘤细胞株A2058作为靶细胞,人永生化上皮细胞Hacat为对照细胞,采用cell-SELEX技术,通过12轮筛选,富集特异性结合恶性黑色素瘤细胞A2058的特异性核酸适配体。同时利用流式细胞术,对筛得的次级文库进行流式检测,验证其与高侵袭性恶性黑色素瘤细胞A2058的特异性结合能力。最后,通过高通量测序,结合DNA MEN及oligoanalyzer软件预测核酸适配体序列的结构,在体外合成的次级文库中获取十条核酸适配体序列,再利用流式术验证其与A2058细胞的特异性结合能力。[结果]1.通过cell-SELEX平台富集适配体文库·通过PCR扩增优化退火温度,确定50℃为最佳退火温度根据引物Tm值,设定退火温度区间为50℃～65℃。根据目的条带的亮度、清晰度、弥散度及非特异性情况选取退火温度。通过RT-PCR凝胶电泳发现,在50℃退火温度下,目的条带亮度最大,条带无弥散且无明显非特异性条带。因此,确定50℃为PCR扩增最佳退火温度。·通过PCR扩增优化引物浓度,确定5uM为最佳引物浓度在相同的PCR反应体系下,设置不同引物浓度梯度：1μM,2uM,3uM, 4uM,5uM,6uM,7uM,8μM,9uM。根据目的条带的亮度、清晰度、弥散度及非特异性情况选取引物浓度。在5uM引物浓度下,目的条带亮度最大,条带无弥散且无明显非特异性条带。因此,确定5uM为PCR扩增最佳引物浓度。·优化筛选条件,富集最佳适配体文库通过调整筛选压力,提高筛选所得核酸适配体的特异性和亲和力,同时利用RT-PCR技术确定每轮筛选PCR扩增最佳循环数。在此条件下,经过12轮筛选,获得了针对人恶性黑色素瘤细胞A2058的富集文库,通过流式细胞术实验证实,筛选得到的次级文库可特异性识别恶性黑色素瘤细胞A2058,而对对照细胞Hacat无识别。2.高通量测序及核酸适配体的结构信息分析对第12轮ssDNA文库进行高通量测序,可见文库有良好富集。利用DNAMEN和oligoanalyzer软件对前20条序列进行结构信息分析,发现序列一级结构根据同源性可分四部分；二级结构以茎环结构为主。3.流式细胞术检测核酸适配体与细胞的结合情况经流式细胞术验证,获得3条可特异性识别人恶性黑色素瘤细胞A2058的核酸适配体序列：Seq7, Seq8, Seq10,研究发现,Seq7, Seq8, Seq10可特异性识别A2058细胞,但识别能力欠佳。[结论]通过cell-SELEX技术可筛选出特异性结合人恶性黑色素瘤细胞A2058的核酸适配体。Seq7, Seq8, Seq10可特异性识别人恶性黑色素瘤细胞A2058。