研究背景口腔种植经常面临的一个的挑战是患者牙槽嵴严重的吸收,吸收往往导致牙槽嵴高度和宽度降低而致种植困难。近年来,大量技术和骨替代材料如上颌窦提升术、引导骨再生术、骨劈开术、自体骨移植、骨生长因子材料、骨髓干细胞材料、高分子生物材料等用来解决这一问题。然而,即便应用技术和这些材料仍存在不足,如需要复杂的外科手术,需要第二个手术部位,成本昂贵,不能启动内源性生物因子,成骨作用效能不明显,引起局部炎症等。任何的骨损伤都可以通过释放和局部产生的生长因子和某些信号分子激活局部骨再生,骨愈合过程中涉及多种细胞成分,包括成骨细胞、干细胞和生长因子,如血管内皮生长因子和骨形成蛋白-2 (Bone Morphogenetic Protein-2, BMP-2),为了提高骨再生,许多研究组织试图将生物活性物质如蛋白质及不同药物加入骨替代用品,一个理想的骨移植替代物应该具有骨传导、骨诱导、生物相容性、生物可吸收性,且方便、廉价、易于使用,生物学安全。运用非蛋白小分子刺激骨内源性信号分子以促进骨缺损愈合,小分子药物已作为间接的促进成骨的替代路线,成为近期的研究热点。辛伐他汀(Simvastatin, SV)是一种临床上常用的降低血清胆固醇含量的小分子药物,文献报道其能提高骨形成蛋白-2的表达并促进骨髓间充质干细胞迁移到骨缺损部位、通过促进血管生成、增强新生骨组织中成骨因子的表达和抑制破骨细胞活性从而提高成骨作用。然而,SV是一种非活性的脂溶性药物,具有不易被机体吸收、血浆半衰期短、口服给药后摄入率低等缺点,因此,寻找合适的药物载体以增加SV水溶性进而促进SV的成骨作用成为当前的研究热点。目前,纳米化制备技术逐步正成为解决一些药物制剂难题的重要手段。纳米药物即利用纳米化制备技术将药物直接纳米化或应用纳米载药系统,使药物粒子的粒径控制在1000 nm以内,从而改变药物在制剂中的存在状态和性能。单甲氧基聚乙二醇(PEG)-聚乳酸(PLA)嵌段共聚物(MPEG-PLA),是一种高度生物相容的药物传递系统,并具有良好的生物降解性,载药效率高、稳定性高、多种表面功能化、可以维持药物浓度在目标位点,延长其药理活性；可通过肾脏排出体外等诸多优点因而倍受关注。MPEG-PLA为纳米级核壳型的球形结构,具有独特的核心-壳结构,“内核”由疏水部分组成,“外壳”由亲水部分组成。这种结构使其具有增强穿透与潴留效应的被动靶向的功能,能够在目标部位如肿瘤组织及炎症组织停留较长的时间。聚合物纳米颗粒主要作为癌症治疗和其他领域的一种先进的药物输送系统。目前,国内外关于MPEG-PLA纳米粒载SV修复颅骨缺损的研究甚少,关于载SV MPEG-PLA纳米粒复合无机牛骨骨粉的研究尚无报道,载SV MPEG-PLA纳米粒是否能在临床上广泛应用于骨缺损修复仍需深入研究。根据国内外研究进展,我们提出：采用MPEG-PLA聚合物纳米粒作为SV的药物载体,有可能将疏水的SV改变为亲水使之具备缓释特性,从而增加SV的局部浓聚效应,并由于纳米粒本身的理化性能有可能增加SV的促成骨效应,该科学假说拟通过动物实验加以印证。目的1.制备具备纳米特性的药物SV载体,研究其理化特性；2.研究证实载SV的MPEG-PLA纳米粒具备缓释特性；3.通过动物实验,证实载SV的MPEG-PLA纳米粒优于单纯SV的局部成骨效应；4.研究SMP是否通过促进骨形成蛋白2(BMP-2)的表达,以增强局部成骨效应。方法1.用改良自乳化溶剂扩散法(SESD)法制备空白MPEG-PLA纳米粒和辛伐他汀加载MPEG-PLA纳米粒(SMP)。用激光粒度仪检测SMP的粒径大小及分布、分散性指数(P1)和Zeta电位；在透射电子显微镜(TEM)下观察SMP的形态；用紫外分光光度法检测SMP的包封率(EE)和载药量(DL)；采用和差示扫描量热法(DSC)及傅立叶红外光谱法(FT-IR)检测SMP中SV和聚合物材料的物理化学状态；观察SMP、SV及其分别与BioOss(?)复合的支架材料的体外释药。2.载辛伐他汀PEG-PLA纳米粒修复兔颅骨标准骨缺损的动物实验(1)选取16只6月龄大,体重3-3.5kg的新西兰健康雄性白兔,随机编号为1～16号。动物实验按植入材料分为4组即SMP组、SV组、BS组和BC组,SMP组为5mg SMP(含0.5mgSV)和5 mg BioOss(?)骨粉混合而成的复合材料,SV组为0.5mg SV和5mg BioOss(?)骨粉混合而成的复合材料,BS组为5 mgBioOss(?)骨粉和BC组不进行材料干预的空白对照组。每只白兔沿颅骨的顶骨及额骨正中线两侧用直径8 mm高速环形取骨钻小心截取骨板,一边各两个,缺损间隔不小于2毫米,深约1 mm,保留硬脑膜完整,制作4个颅骨全层缺损的标准骨缺损模型。4个骨缺损模型随机分别植入上述3种材料,剩下一个骨缺损模型作空白对照组BC组。粘骨膜瓣复位,丝线间断缝合。观察术后白兔的生活状态。(2)所有动物术后4周处死,对骨替代材料及相邻骨组织进行组织学、免疫组织化学观察和组织形态学测量分析。取出标本基于大体形态学、影像学研究新骨愈合的特征；制作硬组织切片,采用荧光标记法通过荧光显微镜观察新骨生成情况以及骨替代材料降解情况；利用常规病理学研究脱钙切片,进行HE染色、Masson染色和BMP-2细胞因子免疫组化染色,通过HE染色法检测骨缺损修复中骨细胞、骨小梁、血管和骨基质的生成情况,利用图像分析软件(Image-Pro Plus 6,IPP)测量新生骨面积百分比,每组样本量均为16个；用马松三色(Masson)染色法检测骨缺损修复中骨胶原基质的分泌情况；利用BMP-2免疫组织化学染色法观察成骨细胞特异性因子BMP-2和成骨细胞分化的标记物的表达,用图像分析软件软件分析缺损区域图像BMP-2相对表达量,每组样本量均为16个。3.采用SPSS16.0统计分析软件,对脱钙切片HE染色的新生骨面积百分比、BMP-2免疫组化染色的BMP-2相对表达量进行统计学分析,结果均以平均值±标准差(x±s)来表示,首先对组织形态学测量数据进行正态分布和方差齐性检验,若满足正态分布和方差齐,采用单因素方差分析(one way ANOVA test),则组间进一步行两两比较(Bonferroni检验方法)；假设检验为双侧检验,检验水准P=0.05。当P>0.05时,差异被认为无统计学意义；当P<0.05为差异有统计学意义。结果1.载SV的MPEG-PLA聚合物纳米粒的特点制备的SMP粒径值平均为41.3±1.6 nm,PDI为0.162±0.08,zeta纳米颗粒的电位是-8.01 mV。TEM观察显示：SMP外形呈球形、形态规整、表面光滑、分散均匀、没有粘附和聚集现象；载药量为(7.23±1.05)%,包封率为(39.12士1.65)%。用DSC和FT-IR分析可见,大多数SV被包裹在合成的SMP里,仅少量药物吸附在纳米粒的表面。由SMP和SV体外释放曲线可见,SMP中SV具有缓慢的药物释放率,9.8%的SV在前3小时内释放,6天内释放75.55%。两种复合材料中SV的释放与单纯SMP和SV体外释放曲线无明显区别。2.SMP对兔颅骨标准骨缺损的修复效能及特点(1)SMP在兔颅骨标准骨缺损的修复大体特征。术后16只新西兰大白兔均无死亡,切口愈合,术区无裂开、无血肿溃烂、无感染,饮食、活动、体重正常。大体形态学观察可见SMP组颅骨缺损区被硬组织覆盖,中央见部分骨粉颗粒,表面尚光滑,厚度均匀,色微红,与周边旧骨质有明显骨融合,钙黄绿素荧光物与新骨结合显黄色较多,质地较硬。 SV组颅骨缺损区表面及周边部骨痂形成,色灰白,质地较硬,中央部略凹陷,较边缘为薄,边界模糊,中央见骨粉颗粒有新骨生成,钙黄绿素荧光物与新骨结合显黄色；BS组边界清,缺损区可清晰见大量骨粉颗粒,期间有少量新骨生成；BC组骨缺损区中央局部凹陷,为纤维组织覆盖,成暗红色,质软,周边可见少量新骨形成,边界清晰可辩。(2)SMP组兔颅骨标准骨缺损的修复的影像学特征。影像学研究可见SMP组缺损区域内密度最高,可见局部高密度骨岛,周边与正常组织界限模糊；SV组缺损区内密度较BS、BC组高,缺损区范围变小,BS、BC组界限清楚,低密度影但可见边缘密度稍高。CT三维重建图可见SMP组缺损区愈合,边界模糊；SV组缺损区愈合,边界尚清楚；BS组缺损区范围变小,可见边缘有新骨形成；BC组缺损区范围最大,边界清楚。SMP组影像学显示兔颅骨骨缺损的新骨量较其他三组有明显增加。(3)SMP组兔颅骨标准骨缺损修复的组织形态学特征。在荧光显微镜下,四组植骨区均可见亮绿色荧光带,在术后4周内新骨形成量比较：SMP组>SV组>BS组≥BC组。通过HE染色,镜下观察到骨替代材料BioOss(?)间粉红色和均质结构,吸收较少。SMP组在缺损区有明显的纤维组织和成骨细胞。BC组缺损主要是纤维和软组织填充。高倍镜下观察,SMP组标本显示：新骨大量形成,组成薄的织物,外周存在不规则的小梁和成骨细胞；成骨细胞的细胞核染色为紫色,呈多核分裂象如梭形或多角状,并有多个突起呈不规则形状,表明成骨细胞处于活跃期。还可见新生骨组织和新生血管,骨小梁多见。(4)SMP组兔颅骨标准骨缺损的修复效能。SMP组标本中新骨面积比(23.98±1.92%)明显高于其他三组,统计学处理差异有统计学意义(P<0.05)。SMP组明显高于SV组(18.90±1.23%),差异具有统计学意义(P<0.05)统计学分析P<0.05,两组间差异有统计学意义。SV组新成骨面积(18.90±1.23%)显著高于BS组(8.78±0.43%)和BC组(8.29±1.83%),有显著性差异,统计学分析P<0.05,两组间差异有统计学意义。BS组的新骨面积比(8.78±0.43%)略高于BC组(8.29±1.83%),统计学分析P=-0.617>0.05,两组间差异无统计学意义。马松三色染色高倍镜下显示,SMP组大量新骨胶原纤维和骨矿化的主要成分染成深蓝色,并连接形成骨小梁结构；新生骨胶原纤维染成深蓝色表现相对成熟,排列整齐；成骨细胞被类骨质包绕形成骨细胞,形成骨陷窝,有钙盐沉积的骨细胞及骨陷窝结构呈现蓝染；同时,在骨胶原或骨替代物中可见活性成骨细胞细胞核染色呈粉红色。SMP组新骨胶原纤维明显多于其他3组。(5)在兔颅骨标准骨缺损的修复中,SMP对BMP-2因子表达的影响在SMP组缺损区新形成的类质骨或骨替代物周围,明显可见BMP-2+细胞。BMP-2+细胞,细胞核染成深棕色,呈多核分裂象,如梭形或多角型；SMP组(93.02±7.98%)和SV组(77.63±9.25%)BMP-2阳性的细胞数量百分比均明显高于BC(25.60±5.44%)组和BS(30.60±5.71%)组,统计学分析P<0.05,两组间差异有统计学意义；SMP组(93.02±7.98%)明显高于SV组(77.63±9.25%),差异具有统计学意义(P<0.05)。SV组(77.63±9.25%)高于BC组(25.60±5.44%)和BS组(30.60±5.71%),差异有统计学意义(P<0.05)；BC组(25.60±5.44%)略低于BS组(30.60±5.71%),但差异无统计学意义(P=-0.553>0.05)。结论1.改良的载辛伐他汀聚合物纳米粒的制备方法简便易行、重复性高。SMP具有分布均匀、形态规整、稳定性好、有效的提高辛伐他汀的溶解性、缓慢释放药物并持续维持局部高浓度等特征,可作为SV药物有效载体,值得推广应用。2.SMP作为SV药物的有效载体,局部给药能显著提高SV局部药物浓度和持续作用时间,SMP是通过促进BMP-2的表达,有效提高骨缺损处的新骨形成效率,加速骨损伤的愈合。