亚型鉴定是禽流感病毒研究的一项基础而重要的工作。由于禽流感病毒的不断进化,给禽流感病毒的诊断工作带来了新的问题。目前常用的亚型鉴定方法是RT-PCR反应,而引物决定RT-PCR反应的特异性和灵敏性。为适应禽流感病毒的变异,RT-PCR反应中使用的引物需要不断的更新。因H5、H7、H9、H3、H4和H6,N1、N2、N6、N8及N9为目前流感病毒的优势亚型,根据本实验室已有的及GeneBank中的序列,进行比对,使用Primer5软件设计这些亚型的HA和NA的通用扩增引物及特异性的鉴定引物。禽流感病毒的内部基因相对比较保守,下载各亚型禽流感病毒的六个内部基因序列,比对后,设计通用引物。在测序方面,采用一对M13F/M13R引物替代之前的分节段测序引物。采用优化的引物对2013-2015年边境省份的禽流感流行病学调查中分离到的41株禽流感病毒进行了亚型鉴定和序列测定。包括5株H5N6亚型、2株H5N1亚型、10株H3N2亚型及24株H9N2亚型。对41株病毒株进行全基因组测序分析发现:5株H5N6亚型禽流感病毒集中于clade2.3.4.4分支;2株H5N1亚型禽流感病毒属于clade2.3.2.1c分支;10株H3N2亚型禽流感病毒均处于欧亚禽源病毒分支;24株H9N2亚型禽流感病毒都分布在BJ/1/94亚群。关键氨基酸位点分析发现:所有H5亚型病毒HA蛋白裂解位点均有多个连续的碱性氨基酸,符合HPAIV的特征;所有H3和H9亚型病毒HA蛋白裂解位点均不含有多个连续的碱性氨基酸,符合LPAIV的特征。同源性分析发现:2株从虎体内分离到的H5N1亚型禽流感病毒为重组病毒,其内部基因由H9N2亚型禽流感病毒提供。H9N2禽流感病毒为感染人的流感病毒,如1997年的香港H5N1禽流感病毒、2013年的H7N9及H10N8禽流感病毒,这些新型重组病毒提供了内部基因片段,并在新型禽流感病毒的产生中起重要作用。H9N2亚型禽流感病毒在我国流行甚广,本实验室近年来从哺乳动物体内分离到了多株H9N2亚型禽流感病毒。为探究H9N2亚型禽流感病毒对哺乳动物的致病机制,选取Civet/GX/S9/13(H9N2)病毒株在小鼠上进行了致病性和适应性研究。原代Civet/GX/S9/13(H9N2)仅在BALB/C鼠的肺脏和鼻甲骨中呈较低程度的复制,对小鼠不致死,呈低致病性。将该病毒在BALB/C鼠体内继代感染,其在小鼠的肺脏和鼻甲骨中复制滴度增高,第8代病毒致死BALB/C鼠,对BALB/C鼠的致病性增强。分析继代感染病毒的氨基酸位点,发现只有PB2蛋白上有三个氨基酸位点发生了突变。在上述研究的基础上,以Civet/GX/S9/13(H9N2)为模式病毒,利用反向遗传技术开展了H9N2亚型禽流感病毒对哺乳动物致病性差异的分子机制研究。建立了模式病毒的反向遗传操作系统,通过鸡胚感染和小鼠感染实验证实了救获的亲本病毒保持了野生型病毒原有的生物学特性。