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结肠癌是常见的恶性肿瘤之一,具有较高的发病率和死亡率,严重危害社会和公众健康。目前,治疗结肠癌的常用方法包括化疗、放疗和手术切除等。其中,化疗是治疗结肠癌最常用的策略,但化疗药物大多为注射给药,具有靶向性差、疗效不佳、不良反应多等缺点。因此,开发相关靶向药物递送系统是一种有效手段。基于此,本课题以伊立替康（Irinotecan,IRI）和紫杉醇（paclitaxel,PTX）作为模型药物,构建由能被MMP-2（人源性基质金属蛋白酶-2）识别和降解的TM肽（由细胞穿膜肽TH肽和MMP-2作用底物GPLG肽偶联而成TH-GPLG肽）修饰的纳米递送系统,用于智能靶向、协同治疗结肠癌,以期增强抗肿瘤疗效。本课题研究内容分为以下五个部分:第一部分,将伊立替康以酯键为连接臂与D-α-生育酚琥珀酸酯（TOS）合成伊立替康前药（IRI-TOS,IT）,通过红外光谱,核磁共振氢谱和高分辨质谱验证伊立替康前药的成功合成;通过乳化溶剂挥发法制备载伊立替康前药的纳米粒（IT NPs）并对其进行药剂学评价;通过粒径仪测定IT NPs的粒径为128 nm左右,PDI小于0.3,纳米粒电荷近中性,为1.34 m V左右;通过TEM观察到IT NPs为大小均一的球形结构;通过IT NPs和血清孵育实验证实了其在血浆中的稳定性;通过考察IT NPs在酯酶条件下的降解行为和体外药物释放证实了IT NPs具有酯酶敏感性,即在酯酶存在的条件下能被降解,而在酯酶不存在的条件下能保持稳定。第二部分,通过蛋白印迹法验证MMP-2酶在人结肠癌HCT-116细胞、HT-29细胞中处于高表达,而在人正常结肠细胞NCM-460中处于低表达;并通过高效液相色谱法验证了MMP-2响应性TM肽中GPLG肽能够被MMP-2识别和降解,从而暴露TH肽。第三部分,在制备IT NPs的基础上,采用乳化溶剂挥发法,筛选出共载PTX和IT纳米粒（PTX-IT NPs、PTX-IT-TH NPs、PTX-IT-TM NPs）的最优处方;通过粒径仪测定三组纳米粒的粒径均小于150 nm,电位在8 m V到22 m V左右,PDI均小于0.3;通过测定三组纳米粒的PTX包封率在76-79%左右,载药量在3%左右;通过TEM观察到PTX-IT-TM NPs为大小均一的球形结构;通过差热分析实验证实PTX和IT以无定型状态分散在纳米粒中;通过体外释放实验证明纳米粒在酯酶的作用下加快了PTX的释放,表明共载PTX和IT纳米粒具有酯酶刺激响应的药物释放特征。第四部分,采用香豆素6（Coumarin,COU）作为荧光探针,在制备共载PTX和IT纳米粒的基础上制备COU-IT NPs、COU-IT-TH NPs和COU-IT-TM NPs,通过荧光倒置显微镜定性观察和流式细胞定量摄取实验,验证三种制剂在结肠癌细胞HT-29、HCT-116的摄取情况。结果显示,TH肽和TM肽修饰的COU-IT-TM NPs和COU-IT-TH NPs的细胞摄取水平明显高于无肽修饰的COU-IT NPs。通过COU-IT-TM NPs和预先用MMP-2孵育的COU-IT-TM NPs,观察两者在NCM-460细胞内的摄取情况,进一步验证了GPLG肽链对TH肽具有“钝化”作用,同时GPLG肽链能被MMP-2特异性识别并降解。第五部分,通过MTT法,考察共载PTX和IT纳米粒的细胞毒性。实验结果表明IT NPs能够有效地抑制肿瘤细胞增殖,且IT和PTX具有协同的抗肿瘤效应。相比IT NPs和游离PTX,PTX-IT NPs具有明显的增殖抑制效果,其中PTX-IT-TH NPs、PTX-IT-TM NPs表现出最为显著的增殖抑制效果,并且两者之间表现为相似的增殖抑制结果,即纳米粒制剂对细胞抗增殖作用为:PTX-IT-TH NPs≈PTX-IT-TM NPs＞PTX-IT NPs＞IT NPs＞PTX;3D肿瘤球的生长抑制实验结果与细胞抗增殖实验结果相一致,相比IT NPs和游离PTX,PTX-IT NPs具有明显抑制肿瘤球的效果,其中PTX-IT-TH NPs、PTX-IT-TM NPs表现出最为显著的肿瘤球抑制效果,且破坏了肿瘤球的结构。综上所述,本研究成功构建了MMP-2响应型TM肽修饰的共载PTX和IT的PLGA纳米粒。首先,修饰在纳米粒表面的PEG2000链能使纳米粒在血液中保持稳定而实现长循环作用;其次,由于纳米粒表面的GPLG肽对TH肽起“钝化”作用,避免TH肽非特异选择性穿膜而能够到达肿瘤部位;再次,在肿瘤部位由于MMP-2酶的存在,GPLG肽被降解,TH肽被激活,发挥穿膜作用,介导纳米粒进入肿瘤细胞;最后,由于肿瘤细胞内存在大量酯酶,IT被降解,纳米粒能够释放出PTX和IRI,实现协同治疗作用,从而增强抗肿瘤效果。