脓毒症是由感染引起的宿主反应失调,会导致威胁生命的器官功能障碍综合征,具有高发病率和死亡率,并且临床诊断和治疗非常困难。每年,由感染发展至脓毒症的患者数量达到数百万,死亡率为22%～55%。糖萼是细胞表面上的多糖-蛋白质复合物结构,主要由蛋白聚糖和糖胺聚糖组成,具有重要的生理功能,例如维持血管的通透性,传递机械力和调节微血管环境。研究表明,糖萼将在脓毒症发病时率先损伤,从而增加内皮通透性,血浆蛋白将泄漏到间隙中,引起组织水肿,同时损害组织氧供应和营养供应。因此,开发有效保护糖萼的药物对降低脓毒症患者的死亡率具有重要意义。肠道也被称为脓毒症发展的“始动器官”,其感染是导致脓毒症在机体内部迅速扩展的重要因素。肠道内有复杂的肠道内菌体环境,会释放出各类毒素,如内毒素、热原等。上述毒素在侵入血液循环系统之前,必须突破肠黏膜屏障,而糖萼作为肠黏膜屏障的重要组成,在脓毒症肠道感染中受损严重。因此,保护肠道糖萼具有重要价值。肝素在脓毒症治疗中常用作高凝状态的预防,也发现肝素对可导致糖萼破坏的乙酰肝素酶(Heparanase,HPA)有明显的抑制作用。然而,肝素因其具有的强大的抗凝活性,治疗脓毒症时会有潜在的出血风险,因此,具有低抗凝活性,对糖萼层有良好保护作用的肝素衍生物的研究和开发具有重要的临床应用价值。肝素葡糖醛酸N位脱硫酸乙酰基全乙酰化的肝素衍生物(N-desulfated/acetylated heparin derivative,NDSAH)具有较低的抗凝活性,保持了肝素的骨架结构。本课题在细胞水平和脓毒症小鼠模型上考察NDSAH对糖萼损伤相关因素,包括HPA,基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase-9,MMP-9)以及炎症因子的影响,以探讨NDSAH通过抑制糖萼脱落,从而脓毒症小鼠的作用。本研究取得的主要成果及结论有以下几方面1.肝素衍生物NDSAH的制备及体外抗凝活性研究1.1肝素衍生物NDSAH的制备和结构确证利用强酸性阳离子树脂将肝素钠转型为肝素酸,再以吡啶中和制得肝素吡啶盐。随后在含有甲醇-DMSO溶液中加热脱去肝素糖链上的N-硫酸根,所得的产物再用乙酸酐进行乙酰化获得目标产物。采用NMR进行结构检测,确证其为肝素葡聚糖醛酸N位全乙酰化肝素衍生物,记为NDSAH。1.2羊血浆法测定肝素衍生物NDSAH的抗凝效价采用重钙化羊血浆检测法,以肝素钠为标准品,检测NDSAH抗凝效价,为32.1IU/mg,表明NDSAH在来日临床中出血风险会较肝素大幅降低。2.肝素衍生物NDSAH对FIP脓毒症小鼠模型的生存率影响采用腹腔注射粪便混悬液(Fecal pellets suspended in PBS,FIP)的方法制作脓毒症小鼠模型,以肝素为对照,考察NDSAH对小鼠生存率的影响。结果表明,NDSAH及肝素均能提升脓毒症小鼠的生存率(p<0.05),提高幅度分别为62.5%和 50%。3.肝素衍生物NDSAH对FIP脓毒症小鼠模型的保护作用3.1采用伊文思蓝为指示剂,考察NDSAH对FIP脓毒症小鼠腹膜渗透性的影响结果发现,NDSAH能够显著降低小鼠FIP脓毒症模型腹膜渗透性(p<0.01)。3.2 采用 40kDa dextran-Texas red 及 500kDa dextran-FITC 作为指示剂,检测了 NDSAH对FIP脓毒症小鼠血管内皮糖萼总体积的影响采用FIP脓毒症小鼠模型,分别静脉注射500kDa dextran-FITC、40kDa dextran-Texas red两种荧光检测剂,考察各组间小鼠血管内皮糖萼总体积的变化,正常组、FIP脓毒症小鼠和NDSAH组小鼠血管内皮糖萼总体积分别为105.9μL、37μL和64μL。结果表明,NDSAH能有效抑制脓毒症时全身血管内皮糖萼的脱落。4.肝素衍生物NDSAH对FIP脓毒症小鼠模型肠道保护作用和对炎症因子水平影响4.1 HE法检测造模3h、8h后NDSAH对FIP脓毒症小鼠小肠组织的保护作用分别在造模后3h和8h进行了观察。结果发现,造模3h和8h后,NDSAH均显示出显著保护FIP脓毒症小鼠小肠组织损伤和坏死的作用,且NDSAH保护效果略强于肝素。4.2免疫组织化学法检测造模3h、8h后NDSAH对FIP脓毒症小鼠小肠组织中TNF-α、IL-6、HPA、MMP-9、HS 及 Syndecan-1 表达量的影响4.2.1 TNF-α、IL-6免疫组化结果结果表明,造模3h后FIP脓毒症组TNF-α、IL-6的表达水平较正常组显著升高(p<0.01);与模型组相比,NDSAH可以显著降低TNF-α、IL-6的表达水平(p<0.01)。与模型组相比,肝素也具有抑制TNF-α表达的作用(p<0.01),而对IL-6的表达无抑制作用(p>0.05)。造模8h后FIP模型组中两种炎症因子表达较3h时的水平均下降。与模型组相比,NDSAH仍表现出显著抑制TNF-α表达水平的作用(p<0.01),而对IL-6表达水平仅有降低的趋势(p>0.05)。与模型组相比,肝素组TNF-α水平显著降低(p<0.01),肝素对IL-6的表达无抑制作用(p>0.05)。4.2.2 HPA、MMP-9 免疫组化结果结果表明,造模3h后FIP脓毒症组HPA、MMP-9的表达水平较正常组显著升高(p<0.01)。NDSAH可以降低模型组HPA的表达(p<0.05),但对MMP-9没有显著的降低作用(p>0.05);肝素对HPA、MMP-9均没有显著的抑制作用(p>0.05)。造模8h后FIP脓毒症模型组中HPA、MMP-9表达较3h时的水平均下降。在该时间点,NDSAH能够显著抑制HPA的表达(p<0.05),对MMP-9的抑制作用则不具有显著性差异(p>0.05);与模型组相比,肝素呈现抑制HPA、MMP-9表达的趋势,但无统计学意义(p>0.05)。4.2.3 HS、Syndecan-1免疫组化结果结果表明,造模3h后FIP脓毒症组HS、Syndecan-1的表达水平较正常组显著下降(p<0.01);NDSAH可以显著抑制FIP脓毒症小鼠肠组织中这两种糖萼重要组成成分HS、Syndecan-1的含量下降(p<0.05)。与模型组相比,肝素能够显著抑制脓毒症时Syndecan-1含量下降(p<0.01),但对脓毒症时HS含量的下降没有显著影响(p>0.05)。造模8h后模型组中HS、Syndecan-1含量较3h时有所提高。在该时间点,NDSAH组中HS和Syndecan-1的表达水平均较FIP模型组有提高(p<0.05);而肝素组中仅Syncdean-1表达水平较FIP组增加具有显著性差异(p<0.01),对HS表达水平无显著影响(p>0.05)。4.3 ELISA方法检测NDSAH对小鼠小肠组织MPO活性、血浆中TNF-α、IL-6水平的影响4.3.1 ELISA法检测小肠组织MPO活性结果表明,FIP模型组小鼠肠组织中MPO水平较正常组显著升高(p<0.01),NDSAH可以显著降低FIP脓毒症小鼠MPO水平(p<0.01);肝素组MPO活性与模型组相比无显著差异(p>0.05)。4.3.2 ELISA法检测血浆TNF-α、IL-6结果结果表明,与正常组相比,模型组小鼠血浆中TNF-α、IL-6水平均显著升高(p<0.01);与模型组相比,NDSAH可以明显降低血浆中TNF-α、IL-6水平(p<0.01);与模型组相比,肝素具有抑制TNF-α、IL-6表达上调的趋势,但不具有显著性差异(p>0.05)。5.肝素衍生物NDSAH对LPS所致细胞糖萼损伤的影响5.1 WGA-FITC荧光法检测采用LPS孵育法制作细胞糖萼层损伤模型,以FITC荧光强度为量化指标。结果发现,与正常组相比,LPS作用于所观测的三种细胞HIEC、RAW264.7巨噬细胞和HUVEC,均引起荧光强度的显著下降(p<0.05),表明细胞表面糖萼发生了损伤;与模型组相比,NDSAH作用于三种细胞皆可以显著提高荧光强度(p<0.05),表明NDSAH具有抑制LPS所致三种细胞糖萼脱落的作用;而肝素仅对LPS所致HIEC细胞糖萼损伤有显著保护作用(p<0.05)。5.2原子力显微镜法检测NDSAH对LPS致细胞糖萼厚度及硬度影响的影响采用LPS孵育法制作细胞糖萼层损伤模型。结果发现,LPS作用于HIEC、RAW264.7巨噬细胞,均引起这两种细胞表面糖萼硬度和厚度的下降;NDSAH和肝素作用于这两种细胞,均可以减弱LPS所致的上述改变。5.3激光共聚焦荧光显微镜法检测NDSAH对LPS致细胞表面糖萼损伤的影响采用LPS孵育法制作细胞糖萼层损伤模型,采用FITC-WAG对细胞膜糖萼进行染色观测。结果发现,LPS作用于HIEC、RAW264.7巨噬细胞和HUVEC三种细胞,均导致细胞表面糖萼完整程度下降,而NDSAH和肝素能够抑制LPS所致细胞糖萼损伤。6.结论NDSAH作为非抗凝的肝素衍生物,能够大幅提升脓毒症小鼠生存率,与NDSAH抑制脓毒症时炎症因子TNF-α、IL-6以及HPA、MMP-9、MPO的上调,从而抑制血管内皮及肠道上皮糖萼脱落的作用有关,这为进一步研发NDSAH成为糖萼保护剂用于脓毒症治疗奠定了基础。