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1.目的和意义截至2020年,肝癌是全球第三大致死性的癌症,其中肝细胞癌最为常见,由于肝癌对于化疗耐药性的发生发展,加上固有的细胞干性的增加,肝细胞癌（HCC）的预后极差。因此,找到肝细胞癌的治疗靶点,对肝癌的治疗和预后管理有相当重要的作用。长非编码RNA（lnc RNA）是肿瘤细胞干细胞和化疗敏感度的关键调节器,观察非编码RNA对HCC细胞干性以及耐药的影响,可以有益于揭示非编码RNA在HCC中的调控机制,发掘对HCC细胞干性的调控机制,为HCC干性相关生物学行为的调控网络奠定基础。目前,LINC00680与肿瘤进展的相关性尚不得而知,只有一项研究显示其在胶质母细胞瘤中的重要性。本研究旨在确定LINC00680在HCC干性和化疗敏感度中的作用。2.方法2.1从TCGA数据库中下载肝癌患者的基因表达谱和预后数据,分析多个LNCRNA在癌组织和癌旁组织中的差异表达情况,筛选到差异表达有意义的LINC00680,整理这些患者的预后数据和病理资料,分析LINC00680在TCGA库中表达水平的差异以及对患者预后和生存的影响。2.2在七株肝癌细胞系和一株L02细胞系中分别检测LINC00680的表达量,根据实验结果选出两株高表达LINC00680的细胞系（SNU-449和SK-HEP1）以及一株低表达LINC00680的细胞系（Huh7）来进行后续的实验。体外实验:SNU-449和SK-HEP1细胞分别分成三组:不做处理的常规control组;转染sh-NC的质粒空转载体组;转染sh-LINC00680的沉默LINC00680组。Huh7细胞也分成三组:不做处理的常规control组;转染LINC-vec的质粒空转载体组;转染LINC00680质粒的过表达LINC00680组。q PCR分别检测各个组细胞株的LINC00680和干性标志物的表达量。WB分别检测各个组细胞株干性标志物的表达量。肿瘤干细胞成球实验用来检测各组细胞的干性。2.3利用慢病毒载体建立沉默LINC00680的稳转细胞株,分别向细胞株SNU-449和SK-HEP1内转染慢病毒空载体（sh-NC）和慢病毒载sh-LINC00680,嘌呤霉素筛选稳转细胞进行下一步实验。q PCR检测稳转SNU-449-sh-LINC00680和SK-HEP1-sh-LINC00680中LINC00680的表达情况。平板克隆实验与CCK8实验检测稳转细胞株的耐药情况。平板克隆实验是将稳转的四种细胞SNU-449-sh-LINC00680,SNU-449-sh-NC,和SK-HEP1-sh-LINC00680,SK-HEP1-sh-NC都分为两组,一组加20微克每毫升的5-氟尿嘧啶,一组进行空白对照实验。CCK8实验是设立不同的5-氟尿嘧啶的浓度梯度培养上述细胞系,检测在相同细胞数和相同培养时间内,不同5-Fu浓度对细胞活性的影响。裸鼠成瘤实验:将SNU-449-sh-LINC00680,SNU-449-sh-NC,和SK-HEP1-sh-LINC00680,SK-HEP1-sh-NC细胞通过皮下注射的方式注射到裸鼠的腋下,其中每组半数裸鼠通过腹腔注射5-氟尿嘧啶。记录瘤体每周的体积大小和35天的瘤体重量。最终的瘤体进行固定包埋切片后免疫组化测定瘤体Ki67的百分比。分析LINC00680对肝细胞癌5-氟尿嘧啶化疗耐药的作用。3结果3.1从TCGA数据库中下载到370例肝癌的患者数据以及51例正常人的基因表达谱,随机筛选了一些长链非编码RNA进行表达量分析,发现LINC00680在肝癌和癌旁组织内有明显的表达差异:在肝癌内的表达量高而癌旁组织内的表达量低。（P＜0.01）而其余的长链非编码RNA的表达无差异或者差异不大无意义。受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve,简称ROC曲线）对患者资料的分析显示LINC00680对肝癌有一定的诊断意义（P＜0.01,AUC=0.740）。3.2对各个HCC细胞系和L02细胞系进行q PCR分析LINC00680表达量显示:LINC00680在SNU-182,SK-HEP1,SNU-449,Hep3B,BEL-7405这几个细胞系中高表达（P＜0.01）;在Huh7（P＜0.01）和LM3中低表达。选取比L02表达量高且差异最大的两株细胞:SK-HEP1和SNU-449进行LINC00680的转染沉默实验。选取表达量最低的Huh7细胞进行LINC00680的过表达实验。体外实验中,q PCR检测沉默或过表达了LINC00680的三株细胞系中CD133,OCT4,NANOG,SOX-2以及LINC00680的表达量:其中,沉默LINC00680组的干性标志物表达量显著下调（P＜0.01）,与此同时,过表达LINC00680组的干性标志物表达量显著升高（P＜0.01）。对各个分组中各种干性标志物CD133,OCT4,NANOG,SOX-2的WB检测与q PCR的结果一致。肿瘤干细胞成球实验结果显示:与空白转染组相比,沉默LINC00680可以降低SK-HEP1和SNU-449这两种细胞的干性特征（P＜0.01）。过表达LINC00680可以增强Huh7细胞的干性特征（P＜0.01）。3.3利用慢病毒转染成功建立沉默LINC00680和慢病毒空载体的稳转细胞系:SNU-449-sh-LINC00680,SNU-449-sh-NC,和SK-HEP1-sh-LINC00680,SK-HEP1-sh-NC。q PCR显示:相对于空转组,SNU-449-sh-LINC00680和SK-HEP1-sh-LINC00680组LINC00680的表达量稳定下调（P＜0.01）且能稳定传代。平板克隆实验的结果显示沉默LINC00680可以降低SNU-449和SK-HEP1这两株细胞的耐药性,细胞克隆数显著减少（P＜0.01）。与此同时,与空白载体稳转组对比,沉默LINC00680后的细胞活性降低,加入CCK8试剂后液体的吸光度显著降低（P＜0.01）且在不同5-Fu浓度时都有相同的结果。体内实验显示,沉默LINC00680后SNU-449和SK-HEP1的肿瘤生长明显减慢（P＜0.01）,最终瘤体重量也相应的降低（P＜0.01）。对5-氟尿嘧啶的抗性也有所减低（P＜0.01）。Ki67的免疫组化结果显示,沉默LINC00680后Ki67的百分比显著降低（P＜0.01）,说明细胞的增殖能力降低明显。4结论结合TCGA数据库,相对于正常肝脏组织,LINC00680在肝癌组织中高表达。在体内和体外的研究说明沉默LINC00680可以降低肝癌细胞的干性和化疗耐药的程度,与此同时,过表达LINC00680有相反的作用。说明LINC00680可能成为治疗肝细胞癌的新的靶点。