膀胱移行细胞癌(Bladder Transitional Cell Carinoma,BTCC)是泌尿系最常见的恶性肿瘤,尽管随着治疗手段的多样化,治疗效果有所改善,但是肿瘤的侵袭和转移仍是引起治疗失败和患者死亡的主要原因。因此,研究和明确膀胱癌侵袭和转移的分子机制是十分必要的。本实验主要研究肿瘤转移相关基因1(metastasis-associatedgene 1,MTA1)与膀胱癌侵袭转移的相关性。MTA1在多种肿瘤中被证实与肿瘤的侵袭和转移相关,但在膀胱癌中的表达及与膀胱癌侵袭转移的关系国内外未见报道。本研究首先应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和免疫组织化学染色技术检测膀胱癌组织中MTA1基因的表达情况,并结合临床病理特点探讨MTA1基因与膀胱癌侵袭和转移的关系,构建针对MTA1基因的siRNA真核表达载体,在此基础上,利用RNA干扰技术选择性的沉默人膀胱癌细胞株BIU-87中MTA1基因的表达,通过观察MTA1基因表达被干扰对BIU-87细胞生物学行为的影响,明确MTA1基因在BIU-87细胞中的作用,为MTA1基因与膀胱癌侵袭和转移的相关性研究提供实验依据。实验方法和结果总结如下:第一章转移相关基因1在膀胱移行细胞癌组织中的表达及临床意义研究[目的]:检测膀胱移行上皮细胞癌(BTCC)组织中转移相关基因1(metastasis-associated gene 1,MTA1)的表达情况,探讨MTA1在膀胱癌中表达的临床意义。[方法]:应用RT-PER和免疫组织化学染色技术,检测34例膀胱移行细胞癌中MTA1 mRNA和蛋白表达情况,结合临床病理特征,研究MTA1基因与肿瘤临床分期、淋巴结转移、病理分级的关系,探讨MTA1与膀胱癌侵袭和转移的相关性。[结果]:MTA1mRNA在34例膀胱癌标本及34例癌旁正常膀胱粘膜均有不同程度的表达,34例膀胱癌中41.2%(14/34)标本中MTA1基因过表达(T/N≥2),结合临床病理学特征发现MTA1过表达与膀胱癌的浸润深度、淋巴结转移密切相关。免疫组织化学染色结果发现,MTA1蛋白阳性染色主要定位在细胞核,MTA1蛋白在癌组织和癌旁组织中阳性表达率分别为82.4%及20.6%,高表达率分别为41.2%和5.9%,有淋巴结转移组的BTCC组织中MTA1蛋白表达强度明显高于无淋巴结转移组。MTA1蛋白高表与BTCC临床分期及淋巴结转移呈正相关,但与病理分级无关。[结论]:在膀胱癌及癌旁正常膀胱黏膜中均有MTA1基因表达,MTA1基因过表达与膀胱癌侵袭和转移密切相关,可作为评估膀胱癌恶性潜质的指标之一。第二章针对MTA1基因的SiRNA表达载体的构建[目的]:设计针对MTA1基因的siRNA序列,并构建siRNA真核表达载体[方法]:利用计算机辅助设计软件,根据MTA1基因信息,设计三条针对MTA1基因编码区的siRNA序列,针对编码区799-817,siRNA-1序列:正义链:5′-GAACATCTACGACATCTCC-3′;反义链:5′-GGAGATGTCGTAGATCTTC-3′;1102-1120,siRNA-2序列:正义链:5′-GGATTTCA CGGACATTCAG-3′:反义链:5′-CTGAA-TGTCCGTGAAATCC-3;2020-2038,siRNA-3序列:正义链:5′-GATCCGCAAGCTGCTC-TCA-3′;反义链:5′-TGAGAGCAGCTTGCGGATC-3′。合成含有针对MTA1基因特定序列的寡核苷酸片段,并将其定向克隆入真核表达载体pRNAT-U6.1中,得到重组质粒shMTA1-1,shMTA1-2,shMTA1-3。[结果]:利用PCR方法鉴定重组质粒,DNA测序证实插入序列与设计的序列完全一致。[结论]:成功构建了特异性针对MTA1基因的RNA干扰表达载体。第三章RNA干扰技术抑制MTA1基因在膀胱癌细胞株中的表达[目的]:探讨RNA干扰表达载体(small interference RNAexpression vetor)对人膀胱癌细胞株BIU-87中MTA1基因的抑制作用。建立稳定转染shMTA1的膀胱癌BIU-87细胞系。[方法]:体外培养人膀胱癌细胞株BIU-87,利用Lipofectamine2000瞬时转染细胞,应用RT-PCR筛选出抑制效果最高的shMTA1,将该表达载体转染膀胱癌细胞BIU-87,G418筛选,建立稳定转染重组质粒shMTA1的膀胱癌BIU-87细胞系,应用RT-PCR和Western blot检测其对MTA1基因mRNA、蛋白的抑制效果。[结果]:瞬时转染48小时后用RT-PCR检测MTA1mRNA表达情况,发现shMTA1-1,shMTA1-2表达载体均引起MTA1mRNA不同程度的下调,shMTA1-2比shMTA1-1有更好的干扰效果,shMTA1-3转染后未观察到MTA1mRNA下调,继续用G418筛选shMTA1-2转染的BIU-87细胞,获得稳定转染的shMTA1-2的膀胱癌BIU-87细胞系,利用RT-PCR和Western blot检测对MTA1基因mRNA、蛋白的抑制效果,结果表明BIU-87-shMTA1-2细胞中mRNA和蛋白表达均有明显下调。[结论]:构建的shMTA1表达载体可以有效的抑制转染细胞的MTA1mRNA和蛋白表达,成功地建立了稳定转染shMTA1的BIU-87细胞系。第四章RNAi干扰MTA1表达对BIU-87细胞株生物学行为的影响[目的]探讨MTA1基因沉默对膀胱癌细胞株BIU-87体外生物学行为的影响。[方法]:绘制细胞生长曲线、MTT比色法、平板克隆形成试验检测BIU-87细胞中MTA1基因表达被干扰后膀胱癌细胞的增殖活性的改变,流式细胞仪检测细胞周期变化情况,以Millicell PCF侵袭小室、划痕愈合实验研究细胞体外侵袭、运动变化,并利用粘附实验检测细胞异质粘附能力的变化情况。[结果]:利用绘制细胞生长曲线、MTT比色法、平板克隆形成试验检测BIU-87细胞中MTA1基因表达被干扰后膀胱癌细胞的增殖活性的改变,用空白质粒组和未转染组的BIU-87细胞作为对照,结果表明BIU-87-shMTA1-2细胞的增殖能力明显低于对照组;BIU-87-shMTA1-2细胞克隆形成数明显少于对照组,提示MTA1被干扰后导致BIU-87细胞的增殖能力和克隆形成能力降低;流式细胞分析结果表明,转染了shMTA1-2可以使BIU-87细胞周期在G1期受阻,G1期细胞比例增加(77.47%vs50.18%/50.13%),S期(17.95%vs44.45%/41.82%)和G2+M期(4.58%vs5.42%/8%)比例减少;体外粘附实验发现BIU-87-shMTA1细胞对人工细胞外基质的异质性粘附能力明显弱于空白质粒组和未转染组,后两者之间无差异;Matrigel侵袭模型显示BIU-87-shMTA1细胞穿膜数量明显少于空白质粒组和未转染组;划痕愈合实验结果显示在划痕后8小时、12小时、24小时均观察到BIU-87-shMTA1-2细胞划痕愈合明显滞后于空白质粒组和未转染组,结果显示MTA1基因被干扰后BIU-87细胞运动能力减弱。[结论]:MTA1 RNAi可以降低膀胱癌细胞的增殖能力,降低肿瘤细胞的体外侵袭和运动能力,同时也降低了膀胱癌细胞的异质性粘附能力,表明MTA1基因能促进膀胱癌细胞的侵袭和转移,它的异常表达可能在膀胱癌的浸润转移中起重要作用。