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积雪草(Centella asiatica (L.) Urban)作为一种传统药材,应用历史悠久,现代医学研究表明积雪草可用于烧伤、抑郁症、胃溃疡等相关疾病的治疗。积雪草中起作用的药理成分主要是皂苷及其皂苷元类,包括积雪草苷、积雪草酸、羟基积雪草苷和羟基积雪草酸等,因此这些物质提取和纯化一直是积雪草研究的重点。近几年来的研究表明,以积雪草酸和羟基积雪草酸等苷元出发,合成的一系列苷元衍生物的药理作用明显优于其原始皂苷,可大大提高积雪草酸、羟基积雪草酸等苷元的利用率。但是由于种种原因,这些活性成分的提取率始终不高,从而造成相关产品价格不菲,限制了积雪草产品的开发和应用。因此,研究积雪草苷的提取、分离纯化及水解,有利于高值化利用积雪草资源。针对以上情况,本文系统地介绍了积雪草中的活性成分利用现状,并综述了积雪草中活性物质的提取、纯化及分析方法的研究进展。本课题以积雪草为研究对象,对其活性成分积雪草苷和羟基积雪草苷的提取纯化方法进行了研究,并对从积雪草苷类活性物质出发制备积雪草酸以及羟基积雪草酸的工艺进行了探索,建立了一条关于积雪苷的提取、分离和水解制备积雪草酸和羟基积雪草酸的新工艺。主要内容如下。1.积雪草中积雪草总苷提取工艺研究探明了比色法测定积雪草总苷含量的显色反应条件,该条件下反应体系稳定,2 h内吸光度基本不变,以羟基积雪草苷为对照品、利用该显色条件测定积雪草总苷含量的方法线性关系良好,检测范围较广。最佳显色反应条件为：香草醛浓度为5%、高氯酸用量0.8 mL、反应温度为60℃、反应时间为15 min。利用单因素及正交实验优化了浸渍法提取积雪草总苷的提取工艺,确定了最佳提取工艺条件：以70%乙醇水溶液为溶剂,料液比为1：10,室温下提取3次,每次提取时间为4h。研究了积雪草中积雪草苷的富集部位,结果发现积雪草苷主要富集于积雪草的叶片中,积雪草总苷的含量高达6.12%,而茎部为2.43%,根部含量较低,仅含1.11%。2.大孔吸附树脂纯化积雪草苷和羟基积雪草苷的工艺研究通过大孔吸附树脂对积雪草苷和羟基积雪草苷两种皂苷的吸附和解吸性能以及吸附动力学数据,对HPD100、HPD300、X-5、D101和AB-8等5种大孔吸附树脂进行了筛选,并对最优树脂进行了吸附等温线进行了考察,用Langmuir和Freundlich方程对结果进行了拟合,最后通过动态吸附实验,建立了大孔吸附树脂纯化积雪草苷和羟基积雪草苷的工艺。工艺条件为：树脂HPD100为吸附剂,50%的乙醇水溶液为解吸剂,吸附上样流速为2 BV/h,动态解吸流速为2 BV/h,积雪草苷通过梯度洗脱后(洗脱液浓度10-50%的范围内),回收率可达72.0%,含量从上样前的2.0%提高到21.5%；羟基积雪草苷回收率可达70.4%,含量由上样前的3.9%提高到39.7%(洗脱液浓度10-50%的范围内),可以有效达到富集和纯化积雪草苷和羟基积雪草苷的目的。3.积雪草苷的水解工艺研究建立了一种同时分析测定积雪草苷、羟基积雪草苷、积雪草酸和羟基积雪草酸的HPLC法,该方法线性关系良好,稳定性强,精密度较高,适用检测范围较广。色谱条件为：Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6 mm×250mm,5μm, Agilent);采用动态洗脱,流速为0.6 mL/min;柱温为35℃；检测波长为210 nm。此条件下积雪草苷、积雪草酸、羟基积雪草苷、羟基积雪草酸精密度的RSD分别为0.35%、0.24%、0.17%、0.18%,稳定性的RSD分别为0.54%、0.46%、0.44%、0.35%,平均加样回收率分别为101.09%、99.57%、100.86%、99.99%,均符合我国药典对药物分析的要求。可以应用于积雪草苷、羟基积雪草苷、积雪草酸、羟基积雪草酸的含量测定。研究了积雪草苷和羟基积雪草苷的水解工艺。通过对催化剂、反应溶剂、皂苷初始浓度、反应时间、反应温度对水解的影响研究发现：最适于积雪草苷的水解的为强碱NaOH;反应溶剂为50%的乙醇水溶液；在本实验所选择的皂苷浓度范围内(积雪草苷0.22～1.10mg/mL;羟基积雪草苷0.40～1.20 mg/mL)水解反应的变化不明显；随着反应温度的升高,皂苷水解的反应速率明显增加,并且在实验温度范围内羟基积雪草苷的水解快于同等条件下积雪草苷的水解。用Arrhenius方程对两种皂苷的水解过程进行拟合,表明积雪草苷和羟基积雪草苷的水解过程符合一级反应,其反应活化能分别为70.1 kJ/mol和83.3 kJ/mol.通过以上研究,本文建立了一套完整的包括从积雪草原草出发,提取积雪草总苷,大孔树脂富集和纯化积雪草苷和羟基积雪草苷,最后水解制备积雪草酸和羟基积雪草酸的流程,该工艺有效地避免了常规萃取法生产积雪草活性物质高耗能、重污染的缺点,经过该工艺制备的积雪草酸的纯度达91.3%,收率为54.8%,为高效地生产制备积雪草三萜化合物,合成新的积雪草酸或羟基积雪草酸衍生物提供了基础。