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番茄灰霉病是由灰葡萄孢菌引起的真菌性植物病害,该菌株侵染的范围比较广泛,可以侵染番茄、黄瓜和葡萄等多种植物,广泛分布于全球各地。番茄是我们国家的重要经济农作物,每年都会因受灰霉病的危害而其使产量大大降低。在过去的几十年里,对番茄灰霉病防治的主要方法是使用杀菌剂。但是,由于人们广泛的使用杀菌剂,不仅造成了环境的污染,而且番茄果实中所残留的化学成分也对人类的健康也存在潜在的威胁,而且依照目前的情况,再用杀菌剂控制植物的灰霉病害也存在困难了。因此,将目光投向自然,寻找拮抗微生物和其代谢物是控制植物病害减轻杀菌剂危害所造成的损失的最佳选择。本研究对番茄植株的根际土壤放线菌的分离和生理活性做了初步的研究。用5种高效的筛选培养基进行放线菌的筛选,并通过其生长形态特征的观察去掉并合并重复菌株。然后利用番茄灰霉病的病原真菌作为供试菌株,将去重后的菌株进行体外平板抑菌活性试验,将活性较好的菌株发酵并测定其发酵液的抑菌活性以及稳定性,结合番茄的苗期试验,对获得的拮抗菌株的抗病能力进行评估。同时,通过天然产物的分离、全基因组的初步分析以及菌株的鉴定,为未来番茄灰霉病的生物防治提供新资源。此外,本研究还发现并鉴定了两株伦茨氏菌属和一株链霉菌属的新种放线菌,不仅为稀有放线菌的分类学提供了新的资源,还丰富了微生物菌种资源库。(1)选用五种分离培养基(GS、DPA、CPA、SSA、HV)对番茄根际土共筛选得到放线菌292株,去除重复,合并后得到120株不同的放线菌。经形态学观测和16S rRNA分子水平检测共分别归类于以下八个菌属:链霉菌属(Streptomyces),小单孢菌属(Micromonospora),原小单孢菌属(Promicromonospora),伦茨氏菌属(Lentzea),韩国生工菌属(Kribbella),野野村菌属(Nonomuraea),马杜拉菌属(Actinomadura)和糖霉菌属(Glycomyces)。(2)对全部经分离纯化的120株菌株以番茄灰霉病病原菌作为供试真菌均进行了平板抑菌活性试验。结果经过多次筛选最终获得抑菌率在50%以上的菌株5株,分别为NEAU-LD23、NEAU-LD86、NEAU-LD90、NEAU-LD93和NEAU-LD99。对这5株菌做了其余9种病原真菌的活性检测,其中NEAU-LD23对番茄灰霉病病原真菌的抑制作用最强,可达81.8%,且广谱抗菌性最好。对菌株NEAU-LD23的发酵液进行抑菌性以及稳定性试验表明,其抑菌活性物质具有耐高温和耐酸性的能力,强碱条件下,活性略有下降。(3)分别以菌株NEAU-LD23的发酵液的原液、5倍稀释液、10倍稀释液和15倍稀释液处理接种病原真菌的番茄幼苗,同CK组作对比,发病率最高由95%下降到45%,病情指数由原来的45下降到25。(4)使用二代测序中的双末端测序对菌株NEAU-LD23进行全基因组测序发现,序列经拼接组装后,得到基因组大小为11,013,522 bp,GC含量为71.33%。预测所到的编码基因的总数为9,182个,非编码基因共69个。通过COG数据库注释结果中显示,有527个基因与次级代谢产物的合成和转运有关,占据总预测基因的6.2%;在KEGG代谢通路注释中,微生物在不同环境中的代谢、次生代谢产物的生物合成以及抗生素的生物合成等通路更是与菌株基因组相比拥有较高的相关度。提交NEAU-LD23的基因组到antiSMASH网站,经分析发现,该菌株具有61个次级代谢产物合成基因簇,编码PKS和NRPS的基因簇共33个,占所预测的总基因簇总数的54.1%。(5)对菌株NEAU-LD23进行16S rRNA分子水平检测、培养特性观察、生理生化特征以及化学结果的比较发现,该菌株为链霉菌属中一株潜在有效菌种;并以同样的方法鉴定了两株伦茨氏菌属和一株链霉菌属的新种放线菌。