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第一部分THP-1细胞中MLL-AF9融合基因的融合位点序列鉴定【目的】从急性单核白血病细胞系THP-1中克隆出MLL-AF9融合基因断裂点序列,并对其进行序列测定分析。【方法】利用RT-PCR方法从急性单核白血病细胞系THP-1中扩增出MLL-AF9融合基因断裂点附近序列,并用T-A克隆方法将其克隆至T载体上,经酶切鉴定后,进行序列测定分析。【结果】从急性单核白血病细胞系THP-1克隆出了MLL-AF9断裂点附近序列,大小为528bp,测序后示MLL基因断裂点位于外显子9,与AF9基因外显子5发生融合。【结论】本实验成功克隆了THP-1细胞系MLL-AF9断裂点的cDNA序列,为针对该序列设计特异性的siRNA进行基因沉默实验做准备。第二部分抑制MLL-AF9融合基因对THP-1细胞增殖的影响【目的】研究MLL-AF9融合基因对急性单核白血病细胞系THP-1细胞增殖的影响。【方法】选择THP-1细胞特有的MLL-AF9融合基因为靶基因,设计并合成siRNA片段。以人急性单核白血病细胞系THP-1为靶细胞,应用脂质体转染方法,将siRNA导入细胞,通过流式细胞仪检测siRNA转染效率,RT-PCR法比较转染前后MLL-AF9 mRNA表达水平的变化,MTT法检测细胞增生抑制率,并通过Hoechst33258染色观察siRNA作用于THP-1后细胞凋亡形态特征,流式细胞仪检测细胞凋亡水平和细胞周期的改变。【结果】siRNA转染效率为69.1%±1.8%,转染siRNA后MLL-AF9基因表达量大幅度减少(P<0.01),THP-1生长受到明显抑制,G0/G1期细胞增多(P<0.01),S期细胞减少(P<0.01),并使细胞周期阻滞于G0/G1期;凋亡小体增多,凋亡水平增加(P<0.01),而对照组则无上述表现(P>0.05)。【结论】MLL-AF9融合基因维持和促进人急性单核白血病细胞THP-1的增殖。第三部分MLL-AF9融合基因对THP-1细胞p27表达调控的影响【目的】研究MLL-AF9融合基因对人急性单核白血病细胞系THP-1的p27表达及转录调控的影响。【方法】选择THP-1细胞特有的MLL-AF9融合基因为靶基因,设计并合成siRNA片段。应用脂质体转染方法,将siRNA导入细胞,通过流式细胞仪检测siRNA转染效率,RT-PCR法比较转染前后MLL-AF9 mRNA表达水平的变化,Western Blot检测MLL-AF9蛋白水平沉默效果,比较细胞周期抑制蛋白p27表达变化,利用染色质免疫沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation ,ChIP)研究MLL-AF9融合蛋白是否与p27启动子结合。【结果】转染siRNA后THP-1细胞MLL-AF9表达明显受抑(P<0.01),p27表达上调(P<0.01),应用染色质免疫沉淀技术结合PCR扩增的方法分析发现MLL-AF9融合蛋白可与THP-1细胞p27基因启动子区域的DNA片段结合。【结论】急性单核白血病细胞系THP-1中的MLL-AF9融合蛋白通过与p27启动子的结合下调p27基因的表达。