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背景：骨肉瘤(osteosarcoma)是骨组织中最常见的恶性肿瘤,来源于问叶组织,大约占原发性骨恶性肿瘤的20%,发病率为(0.01-0.03)/1万。任何年龄均可发病,但好发于青少年。发病率在种族间没有明显差异,与遗传因素关系不密切。本病预后极差,致死率及因截肢造成的致残率均较高,早期经血道、淋巴道发生远处转移是其预后不良的主要原因之一。低氧作为实体肿瘤的特征及生存的重要环境,这不仅让肿瘤自身的侵袭性增加,并且使肿瘤对化疗的耐药及放疗的抗拒性均增加。近年来发现介导肿瘤细胞在低氧环境中最关键的核转录因子是低氧诱导因子-1 (Hypoxia-inducible factor-1, HIF-1),这也是低氧时调控细胞凋亡的重要因素,HIF-1a的表达与多种肿瘤的预后密切相关。当实体肿瘤处在低氧环境时,HIF-1a表达上调且活性显著增高,调节下游多个基因。目前已发现的HIF-1α的目的基因蛋白产物中有与血管生成相关的因子、糖酵解酶、葡萄糖转运酶、与肿瘤侵袭和转移相关的蛋白、与肿瘤增殖和凋亡相关的蛋白等,具体涉及到促红细胞生成素(EPO)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,酪氨酸3-单加氧酶、葡萄糖转运蛋白-1 (glucose transporter, GLUT-1)、GLUT-3、血红素氧化酶I(HMOX1)、诱导型一氧化氮合酶iNO S、糖酵解酶和转铁蛋白(TRF)等,从而有利于肿瘤细胞适应低氧的微环境,并促进肿瘤血管的再生,加强肿瘤细胞能量代谢,最终导致肿瘤细胞的一系列生物学特性的变化。由于化疗药物的最终效应是抑制肿瘤细胞增殖并诱导肿瘤细胞凋亡,故而研究化疗药物诱导低氧状态下肿瘤细胞凋亡中的作用及机制可为临床治疗提供基础和理论依据。环氧合酶(Cyclooxygenase, COX)即前列腺素过氧化物酶合成酶,是花生四烯酸分解生成各种内源性前列腺素(PG)过程中重要的限速酶,有两种形式即COX-1 和 COX-2。 COX-2在骨肉瘤组织中表达上调,COX-2致癌的具体机制仍然不太清楚,但目前的研究发现,它过度表达可增加其代谢产物前列腺素E2(PGE2)合成来促进肿瘤细胞生长和增殖,PGE2还可增加碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和 VEGF等促进血管生成因子的表达而诱导肿瘤血管形成。COX-2在促进肿瘤浸润和转移、抑制细胞凋亡、抑制机体免疫反应等多方面对肿瘤的发生发展均起了极为重要的作用。随着对COX-2的过度表达与肿瘤关系研究的不断深入,学者们发现COX-2抑制剂有抗肿瘤作用。机制可能与减弱肿瘤介导的免疫抑制效应,阻滞肿瘤细胞周期,减少肿瘤血管生成,抑制肿瘤细胞增殖,削弱肿瘤细胞侵袭能力及促进肿瘤细胞凋亡相关。此外还有研究表明COX-2抑制剂抗肿瘤还可以通过非COX-2途径。本研究针对骨肉瘤中 HIF-1α蛋白大量表达的特点,实验以化学性缺氧诱导剂氯化钴(CoCl2)模拟体内骨肉瘤细胞低氧状态,观察COX-2抑制剂NS-398对低氧状态下骨肉瘤MG-63细胞凋亡的影响,并探讨其机制。目的：1.探讨低氧状态下骨肉瘤MG-63细胞凋亡的影响。2.探讨COX-2抑制剂对低氧状态下MG-63细胞周期的影响。3.初步探讨COX-2抑制剂对低氧状态下人MG-63细胞凋亡的影响及可能的机制。方法：选用化学性缺氧诱导剂氯化钻(浓度为200μmol/L)处理骨肉瘤MG-63细胞,建立化学性低氧环境,再将MG-63细胞培养48h后,以不同浓度COX-2抑制剂NS-398(0μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、和100μmol/L)分别作用于造模后的MG-63细胞。设常氧组作对照,行低氧造模后加入不同浓度NS-398分别称作0gmol/L组、25μmol/L组、50μmol/L组和100μmol/L组。1.以四甲基偶氮唑盐(MTT)法分别检测常氧组和对不同浓度的NS-398处理MG-63细胞后24h和48h两个时间段MG-63细胞增殖活力的影响：2.用流式细胞仪分别检测常氧组和不同浓度的NS-398作用后MG-63细胞生长周期变化、发生凋亡的影响。3Western blot分别测定常氧组和不同浓度的NS-398作用后MG-63细胞中HIF-1α蛋白、凋亡抑制蛋白Survivin的表达。结果：1.行氯化钻缺氧造模后,MTT法检测0μmol/L组MG-63细胞的活力较常氧组明显增强(P<0.05),加入NS-398处理24h后,MG-63细胞的增殖受到抑制,48h后MG-63细胞增殖活力明显被抑制,48h后25μmol/L组、50μmol/L组和100μmol/L组的MG-63细胞增殖抑制率分别为30.6%(P<0.05),48.5%(P<0.05),59.4%(P<0.05),并具有剂量-效应关系。2.在低氧状态下的MG-63细胞较常氧组MG-63细胞生长周期发生变化,经不同浓度NS-398处理48h后,MG-63细胞发生G0/G1期细胞周期阻滞,与Oμmol/L组相比,25μamol/L组、50μmol/L组和100μmol/L组MG-63细胞G0/G1期比例增加,S、G2/M期比例降低,各组间差异均有统计学意义(P<0.05)。3.在低氧状态下,0μmol/L组MG-63细胞的中HIF-1α蛋白及Survivin的表达较常氧组增加,加入NS-398处理后,随着其浓度的逐渐增加,MG-63细胞早期及晚期凋亡的所占的比例分别逐渐增加,总凋亡率逐步增加,HIF-1a 及 Survivin的表达逐渐减少。低氧环境是抑制MG-63细胞凋亡增加的重要因素之一,在低氧环境下NS-398可有效促进MG-63细胞凋亡,并随浓度梯度而变化。结论：在低氧状态下,骨肉瘤MG-63细胞凋亡较在常氧状态下显著受到抑制,HIF-1a及Survivin表达均增加。在低氧状态下,经不同浓度NS-398处理后,MG-63细胞发生G0/G1期细胞周期阻滞,随NS-398浓度升高可增加Go/G1期细胞比例,降低S、G2/M期细胞比例；随着NS-398浓度的增加,细胞凋亡率增加,HIF-1α及Survivin的表达减少。低氧环境是抑制MG-63细胞凋亡增加的重要因素之一,在低氧环境下NS-398可有效促进MG-63细胞凋亡,并随浓度梯度而变化。COX-2抑制剂NS-398可能是一种有前景的骨肉瘤化疗药物。