黑尾近红鲌消化酶活性分布及其性质研究

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本论文应用生物化学方法对黑尾近红鲌消化酶活性分布、酶促反应动力学、消化酶的性质及肠道蛋白酶对不同蛋白质的消化能力进行了研究。旨在了解黑尾近红鲌对各种营养成分的消化能力及消化的机理,为黑尾近红鲌的人工养殖及人工饵料的研制提供可靠的理论依据,也为消化酶的研究提供新的方法。其主要结果如下:1.采用生物化学方法测定了黑尾近红鲌肝胰脏及肠道各部位蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶3种消化酶的活性并对3种消化酶的同工酶进行了分析。结果表明:黑尾近红鲌蛋白酶(PRO)由11个基因位点编码,为单体酶,活性大小为前肠>中肠>后肠>肝胰脏,差异显著(p<0.05);淀粉酶(a-AMY)由5个基因位点编码,为单体酶,活性大小为肝胰脏>中肠>前肠>后肠,肝胰脏淀粉酶活性明显高于肠道(p<0.05),肠道各段淀粉酶活性差异不显著(p>0.05);肝胰脏及肠道各段淀粉酶/蛋白酶(A/P)比值均小于1,显示肉食性鱼类特征;检测黑尾近红鲌消化道中存在2种脂肪酶,即甘油酯酶(TG)和羧酸酯酶(EST)。甘油酯酶活性为后肠>中肠>前肠>肝胰脏,后肠和中肠脂肪酶活性差异不显著(p>0.05),但明显高于前肠(p<0.05)和肝胰脏(p<0.05)。聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测到的羧酸酯酶由4个基因位点编码,有单体和二聚体2种表型,肠道中EST同工酶条带的数目及活性均高于肝胰脏。2.在不同pH梯度下,测定了黑尾近红鲌肝胰脏及肠道蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的活性。结果表明:在pH5.5~9.5范围内,黑尾近红鲌肝胰脏中存在酸性和碱性蛋白酶,酸性蛋白酶最适为pH5.5~6.0,2种碱性蛋白酶最适pH分别为7.5和8.5,但活性较pH5.5~6.0时低;在pH6.5~10.0范围内,黑尾近红鲌前肠、中肠和后肠蛋白酶随pH变化的趋势相同且最适pH范围相似,最适pH分别为9.0~10.0、9.0~9.5和9.0~10.0,表明肠道各部位的蛋白酶种类相似。黑尾近红鲌肝胰脏和肠道淀粉酶的最适pH有很大差异,在pH6.0~10.6范围内,肝胰脏淀粉酶最适pH为9.0~10.0;在pH6.0~8.5范围内,检测到黑尾近红鲌肠道中存在3种不同性质的淀粉酶,最适pH分别为pH6.0、7.5和8.5,以pH7.5时的酶活性最高。在pH5.0~8.0范围内,黑尾近红鲌肝胰脏中含有两种甘油酯酶,最适pH分别为6.0和7.5;而前肠、中肠和后肠脂肪酶的最适pH均为7.0。3.在25~60℃范围内,测定了黑尾近红鲌肝胰脏及肠道蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的活性。结果表明:黑尾近红鲌肝胰脏、前肠、中肠和后肠蛋白酶最适温度分别为45~60℃、30~45℃、40~45℃和40~50℃;淀粉酶最适温度均为35~40℃;肝胰脏脂肪酶最适温度为35℃,前肠、中肠和后肠脂肪酶均为40℃。总体来看,黑尾近红鲌消化酶最适温度范围较广,对温度的变化有一定的适应能力。4.采用化学修饰法和聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)技术,研究了苯甲磺酰氟(PMSF)、乙二胺四乙酸(EDTA)、5,5-二硫代(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、N-溴代琥珀酸亚胺(NBS)和巯基乙醇(2-ME)5种修饰剂对黑尾近红鲌肝胰脏及肠道蛋白酶、淀粉酶和羧酸酯酶活力的影响。结果表明:黑尾近红鲌蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶类,二硫键结构也是酶活力所必需,肝胰脏蛋白酶和肠道中的某些蛋白酶活性中心还含有金属离子;黑尾近红鲌肠道淀粉酶活性中心含有金属离子,但肝胰脏淀粉酶活性中心无金属离子的存在,丝氨酸残基、巯基、色氨酸残基和二硫键都不是淀粉酶活性中心的必需基团;黑尾近红鲌肝胰脏及肠道羧酸酯酶活性中心含有丝氨酸残基和二硫键,而巯基、色氨酸残基和金属离子不是酯酶活性中心的必需基团。5.采用SDS-PAGE法检测了黑尾近红鲌肠道蛋白酶对不同蛋白质的消化能力。结果表明:黑尾近红鲌肠道蛋白酶对大豆蛋白和胶原蛋白有很强的消化能力,而不能消化牛血清蛋白和牛血红蛋白,可考虑用胶原蛋白粉、豆粕(饼)和大豆蛋白粉作为蛋白源替代饲料中的部分鱼粉,以降低养殖成本。
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