论文部分内容阅读
MicroRNA(miRNA)是一类高度保守的内源性单链非编码小分子RNA,在基因表达调控过程中起着非常重要的作用,它通过结合于靶基因的特定序列,对基因进行转录后调控,使靶基因的mRNA降解或抑制相应蛋白质翻译表达,从而参与细胞的增生、分化与凋亡等过程。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞,在其分化过程中,涉及多条信号通路及转录因子的参与,而microRNA可以通过靶向参与成骨细胞分化的细胞因子对成骨细胞的分化产生正向或负向调控的作用。干扰素诱导跨膜蛋白5(interferon induced transmembrane protein 5,IFITM5)是又称骨限制性IFITM样蛋白(Bril),已被公认为骨特异性调节剂,其表达量随成骨细胞的分化而增加,并在成骨细胞早期矿化和成熟阶段达到峰值。实验室前期研究中,通过生物信息学软件预测和双荧光素酶报告载体,证实IFITM5是miR-4316的靶基因。但是,到目前为止,还没有生物学证据发现miR-4316靶向调控IFITM5,从而影响成骨细胞的矿化。目的:探究miR-4316通过靶向IFITM5对Saos-2成骨细胞矿化及分化的影响。方法:采用含有50μg/mL抗坏血酸和10mmol/Lβ-甘油磷酸钠的诱导培养液诱导Saos-2细胞,诱导3、7和10天后采用茜素红染色及定量、Von Kossa染色、ALP染色及活性测定评估矿化效果。采用RT-qPCR和Western blot分析矿化相关基因Runx2、OCN、ALP、COL1A1、Osterix、OPG、IFITM5的mRNA表达及Runx2、OCN、IFITM5蛋白的表达。采用riboFECT~TMM CP转染试剂,以100nM浓度瞬时转染miR-4316 mimic、miR-NC和inhibitor,转染Saos-2细胞3天后,通过茜素红染色及定量和Von Kossa染色检测矿化结节的形成,ALP染色检测ALP活性,RT-qPCR和Western blot检测Runx2、OCN、ALP、COL1A1成骨基因与蛋白以及IFITM5的表达。结果:(1)茜素红染色结果显示Saos-2细胞在诱导3天时开始出现少量的矿化结节,随着诱导时间的延长结节量逐渐增多;Von Kossa染色结果显示加入硝酸银后诱导组可见黑色结节,中性红复染后,光镜下可见细胞周围有粉红色细胞结构;ALP染色与活性鉴定显示诱导组较未诱导组的ALP表达量和活性都是明显增高的,且在诱导7天时表达最高;RT-PCR结果表明在Saos-2细胞诱导3天时成骨基因COL1A1和OPG表达最高,诱导7天时成骨基因Runx2和ALP表达最高,诱导10天时成骨基因OCN和Osterix表达最高;Western blot结果表明Runx2和OCN的蛋白表达分别在诱导7天和10天时表达最高。RT-PCR和Western blot结果显示随着诱导时间的延长,IFITM5 mRNA和蛋白的表达量先升高后降低,诱导至第7天时表达量最高。(2)茜素红与Von Kossa染色表明相比对照组miRNA-4316能够抑制Saos2细胞矿化结节的形成。ALP染色与活性鉴定表明miRNA-4316能够抑制矿化过程中ALP的活性。RT-qPCR和Western blot结果表明miRNA-4316能够抑制成骨基因Runx2、OCN、ALP和COL1A1以及靶基因IFITM5的mRNA表达和Runx2、IFITM5蛋白表达。结论:IFITM5的表达量随Saos-2成骨细胞的分化而增加,并在成骨细胞矿化早期和成熟阶段表达最高;本研究首次证实miR-4316抑制Saos-2成骨细胞矿化,且该功能可能是通过抑制其靶基因IFITM5实现的。