【摘 要】
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猪β防御素（pigβdefensin,PBD）基因是抗菌肽家族的重要成员,同样具有低毒低耐药性及广谱抗菌活性,在机体免疫系统中发挥重要作用,为探究防御素基因在不同群体猪中的功能及群体间差异。本试验以NCBI上公布的野猪防御素基因为模板,分别在大白猪、民猪和野杂猪群体中克隆获得目的基因CDS区,并进行生物信息学分析及不同群体猪各组织相对表达水平的检测;通过ELISA方法检测目的基因在外周血中的血清含
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猪β防御素（pigβdefensin,PBD）基因是抗菌肽家族的重要成员,同样具有低毒低耐药性及广谱抗菌活性,在机体免疫系统中发挥重要作用,为探究防御素基因在不同群体猪中的功能及群体间差异。本试验以NCBI上公布的野猪防御素基因为模板,分别在大白猪、民猪和野杂猪群体中克隆获得目的基因CDS区,并进行生物信息学分析及不同群体猪各组织相对表达水平的检测;通过ELISA方法检测目的基因在外周血中的血清含量,同时筛选三群体95头猪中的单核苷酸多态位点并结合血清含量进行关联分析;最后通过抑菌和抗病毒试验鉴定PBD基因的功能。结果显示:克隆获得PBD-2、PBD-110、PBD-119和PBD-121四个目的基因。PBD-119和PBD-121为预测基因,其生物信息学分析结果表明:PBD-119基因编码83个氨基酸,分子量为9.6ku,理论等电点（PI）为9.38,稳定系数为59.43,脂肪系数为76.39,预测其为不稳定的碱性脂溶性蛋白;PBD-121基因编码60个氨基酸,分子量为6.8ku,理论等电点（PI）为8.9,稳定系数为35.48,脂肪系数为107.33,推测其为稳定的碱性脂溶性蛋白;蛋白质结构预测表明两个目的蛋白均存在三种结构,分别为α螺旋、β折叠和无规则卷曲,蛋白磷酸化位点及信号肽预测结果表明,两个蛋白均存在磷酸化位点且属于分泌蛋白,遗传进化结果表明,目的基因符合物种进化规律;目的基因在大白猪、民猪和野杂猪三个群体不同组织中m RNA水平表达情况表明,四个目的基因在不同群体不同组织中均有表达,且表达趋势各不相同。外周血中血清含量检测及基因多态性关联分析结果显示,PBD-2和PBD-110基因均在内含子1上筛选出SNP位点,在PBD-2基因中,T214C存在三个基因型（TT、TC和CC）,基因多肽性分析三个基因型在三群体猪中所占比例分别为:大白猪16.13%、54.84%和29.03%,民猪25%、56.25%和18.75%,野杂猪28.13%、46.87%和25%,TC为优势基因型,三个群体外周血中血清水平均表现为民猪中最高,野杂猪中最低,大白猪中含量居中的趋势;PBD-110基因的C314T位点同样存在CC、CT和TT三种基因型,基因型频率依次为:大白猪51.61%、38.71%和9.68%,民猪78.13%、18.74%和3.13%,野杂猪75%、21.88%和3.12%,CC为优势基因型,外周血中血清含量表现为:民猪高于大白猪高于野杂猪。功能鉴定结果表明:化学合成目的蛋白PBD-121在抗菌方面表现出广谱抗菌活性,对大肠杆菌DH5α、大肠杆菌K88、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺杆菌和绿脓杆菌均产生抑菌圈,最小抑菌浓度依次为:18.38μM、20.06μM、29.4μM、58.8μM、66.18μM和73.5μM;PBD-121蛋白对病毒感染和复制也表现出一定的抑制作用,但作用效果较弱。为进一步探究该基因的抗病毒功能,构建NBL-PBD-121转基因细胞,在抗病毒感染及复制方面同样表现出微弱的抑制作用。本研究为防御素基因的基本生物学功能提供理论基础,也为防御素基因作为抗生素理想替代品候选基因提供参考。
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