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目的:β1,3葡萄糖基转移酶8(β3Gn-T8),又名β1,3半乳糖基转移酶7(β3GalT7),是本课题组首先在国际上克隆获得的人类糖基转移酶新基因。已有研究表明该酶可能与肿瘤侵袭转移相关。本文通过生物信息学方法分析了β3Gn-T8与癌症浸润转移相关基因的联系,并且通过RNA干扰技术和真核正义表达载体技术研究了β3Gn-T8对人胃癌细胞AGS中相关基因表达的调节作用,以期为胃癌治疗提供新的途径。方法:1.遵循RNA干扰目标序列的选取原则,利用互联网资源对β3Gn-T8基因mRNA序列设计三条可能的小干扰RNA( small interfering RNA ,siRNA),通过RNAi-mate介导转染入人胃癌细胞AGS中,设计梯度转染体系,以最高转染效率和最低细胞死亡率为原则,优化siRNA转染AGS细胞的条件。收集转染48 h后的细胞,采用H-E染色观察细胞形态学变化,RT-PCR,Real time-PCR法检测β3Gn-T8基因在转录水平的改变;western blot检测β3 Gn-T8在蛋白水平的改变。确定最有效的siRNA序列。通过流式细胞术和Hoechst33258检测AGS细胞凋亡,MTT比色法检测有效siRNA对AGS细胞增殖的影响。2.从β3GnT家族和β3GalT家族中筛选出与β3GnT-8有较高同源性的基因。通过生物信息学方法筛选出与该同源基因有相互作用的与癌症浸润转移相关的基因,并预测β3Gn-T8与这些基因的作用。3.转染有效β3GnT8 siRNA和pEGFP-C1-β3Gn-T8正义真核表达载体,检测与癌症浸润转移相关基因mRNA水平和蛋白水平表达,明胶酶谱法测酶活,Transwell法检测AGS细胞侵袭能力变化。将随机分成control组,siRNA组, pEGFP-C1-β3Gn-T8-sense组的裸鼠分别给予皮下接种以构建人胃癌细胞AGS异种裸鼠成瘤,在动物实体水平深入研究。结果:1.化学合成三条siRNA分子转染人AGS细胞株,综合最高转染效率与最低细胞死亡率的优化原则,最终选择每1×10~5个细胞100 nmol/L作为转染siRNA的实验浓度,并筛选出其中一条对β3Gn-T8基因抑制效率最高的siRNA序列。检测出转染了该有效siRNA的细胞中β3Gn-T8的mRNA和蛋白表达都受到了有效抑制,同时也引起AGS细胞凋亡,细胞增值受到抑制。2.经过同源性比对,β3Gn-T2与β3Gn-T8有较大同源性。从数据库中筛选出和β3Gn-T2有相互作用的与癌症浸润转移相关基因,发现β3Gn-T2与MMP-2,TIMP-2具有很密切的相互作用,分析作用通路,发现转录因子ETS-1,Jun在其中起重要的调控作用。分析β3Gn-T8上游调控序列,找出转录起始点,预测启动子区和转录因子,发现β3Gn-T8启动子区有一个ETS-1和五个Jun结合位点,猜测β3GnT8与MMP-2,TIMP-2之间也存在一定的调控作用。3.分析了β3Gn-T8和胃癌侵袭转移的关系:转染有效的siRNA后,MMP-2 mRNA和蛋白表达均受到抑制,而TIMP-2的mRNA及蛋白质表达均有所升高;明胶酶谱法检测出MMP2活性降低,细胞侵袭能力降低。转染正义β3Gn-T8表达载体后,MMP-2 mRNA和蛋白表达均升高,而TIMP-2的mRNA及蛋白质表达均降低;明胶酶谱法检测出MMP2活性升高,细胞侵袭能力提高。接种siRNA组的裸鼠成瘤时间明显延长,成瘤率为100%,肿瘤体积和重量明显小于接种AGS组的裸鼠(P﹤0.01);接种pEGFP-C1-β3Gn-T8-sense组的裸鼠成瘤时间明显缩短,成瘤率为100%,肿瘤体积和重量明显大于接种AGS组的裸鼠(P﹤0.01)。结论:采用生物信息学的方法设计出有效siRNA靶位点;siRNA能有效抑制AGS细胞中β3Gn-T8基因的表达,抑制细胞生长,促进细胞凋亡。同时,β3Gn-T8与MMP-2,TIMP-2的表达及肿瘤的侵袭转移能力有一定的相关性,更深入的机制则有待进一步的实验研究。