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新霉素是在弗氏链霉菌发酵过程中产生的一种广谱水溶性氨基糖苷类抗生素,对部分革兰氏菌的生长具有较好的抑制作用。其治疗范围狭窄,与其它氨基糖苷类抗生素药物一样具有潜在毒性,可能引起耳毒性和肾毒性。但硫酸新霉素(新霉素的硫酸盐)作为一种理想的干扰蛋白质合成的杀菌剂,在临床和兽医学中得到了广泛的应用。本研究首先基于多孔板发酵与酶标仪检测,建立及优化硫酸新霉素产生菌高通量选育模型,提高诱变后突变株的筛选效率;并经过6轮ARTP诱变结合链霉素抗性筛选,获得高产突变株Sf6-2;最后利用响应面法对发酵培养基进行优化,成功提高了高产菌株Sf6-2的发酵效价。主要研究内容和结果如下:(1)硫酸新霉素产生菌高通量选育模型的建立及优化。对影响酶标仪检测的主要影响因素1.0×10-4 mol/L曲利本蓝溶液的添加量(μL)进行优化,并建立相应的分光光度法;对适用高通量筛选模型的微孔板种类进行选择,并对其发酵条件进行正交优化。结果表明,硫酸新霉素在1.284～10.272 U/mL范围内,只有当曲利本蓝溶液的添加量为500 μL时,吸光度与样品浓度呈良好的线性关系,线性方程为:Y=0.0320X-0.0262(R2=0.9988),平均回收率为98.4684%,重复性RSD为3.2700%;24孔板适用于高通量筛选模型,优化后发酵条件:转速、装液量和接种量分别为220 r/min、2 mL和8%,在此基础上,实际发酵效价达到6825±77 U/mL,较原发酵条件提高了27.40%。(2)ARTP诱变选育硫酸新霉素产生菌弗氏链霉菌。比较不同链霉素浓度平板中效价差异突变株的分布系数及其抑制作用,确定链霉素的最佳抑菌浓度;进行ARTP迭代诱变结合链霉素抗性筛选,获得高产突变株。结果表明,随着抗性平板中链霉素浓度的增加,具有较高硫酸新霉素效价的突变体分布系数逐渐增大,当链霉素浓度大于10 μg/mL时,菌落数急剧减少几乎为0,为获得较高的突变株筛选效率,以8μL/mL的链霉素为最佳浓度;经过6轮ARTP诱变及链霉素抗性筛选,最终筛选出一株稳产硫酸新霉素摇瓶效价为7780 ± 110 U/mL的突变株,比原菌株效价高出1.45倍,命名为Sf6-2。(3)硫酸新霉素产生菌发酵培养基优化。利用P-B试验设计筛选显著影响因子,通过BBD试验设计结果及数据分析,确定最优发酵培养基成分。结果表明,可溶性淀粉、蛋白胨和硫酸铵浓度对硫酸新霉素发酵效价影响显著;且在可溶性淀粉、蛋白胨和硫酸铵分别为73.98,9.23和5.99 g/L的最优化条件下,实际响应值为10849±141 U/mL,约为预测值的99%,模型的观测精度完全一致,约为Sf6-2突变体发酵效价的1.4倍。