蛛网膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage, SAH)是一种临床常见的危及生命的脑血管重症,具有高致残率和高致死率。尽管近年SAH的研究不断深入,但SAH作为发病原因在休克患者中仍占5-7%。继发性早期脑损伤(Early brain injury, EBI)和迟发型脑血管痉挛(Cerebralvasospasm, CVS)是动脉瘤自发性蛛网膜下腔出血的两大并发症。之前SAH的研究主要集中在血管痉挛,但是随着相应药物进入临床试验阶段后发现,抗CVS药物并不能有效改善SAH患者预后。这使得研究学者慢慢将研究重点转向早期脑损伤,并认为EBI可能是SAH后早期致死致残的主要原因。研究如何减轻SAH后继发EBI对提高SAH患者的生存率及改善预后具有重要的意义。早期脑损伤是最近几年提出来的一个新概念,指从动脉瘤破裂出血那一刻到迟发性脑血管痉挛发生前这一约72h时间窗的脑损伤。蛛网膜下腔出血后脑内发生一系列病理生理改变:包括颅内压升高(Increased intracranial pressure,ICP),脑血流量(Cerebral blood flow, CBF)降低,血脑屏障破坏(Blood-brain barrier, BBB),脑灌注压(Cerebral perfusion pressure, CPP)改变,脑水肿和急性脑血管痉挛等。蛛网膜下腔出血后EBI包含复杂的分子机制,大量研究证实神经元、胶质细胞和小胶质细胞凋亡在SAH后早期脑损伤的形成中起着重要的作用。干预或减轻蛛网膜下腔出血后脑细胞凋亡可能是减轻早期脑损伤,降低死亡率的一条新策略。Nur77(又可以称为TR3, NGFI-B)是一个属于核受体超家族的转录因子,受到相应细胞外凋亡刺激后,Nur77作为一个强有力的促凋亡分子参与多种疾病过程。近年来Nur77的促凋亡特性越来越受到研究者的重视。研究表明Nur77广泛参与了脑退行性疾病、血管重建和肿瘤细胞凋亡等病理过程等从而对机体发挥不同作用。核受体Nur77受到细胞外凋亡因素刺激后,被广泛磷酸化并和维甲酸X受体(retinoid X receptor, RXR)结合形成异源二聚体,出核易位至线粒体,和Bcl-2结合,反转Bcl-2蛋白的细胞保护作用,使其促进细胞色素C(Cytochrome C,cyto C)的释放,最终导致细胞凋亡。研究证实Nur77在原代培养的胶质细胞、神经元均有表达,由此我们假设,激活Nur77可能增加Bcl-2、cyto C等凋亡相关分子的表达继而引起脑细胞凋亡和血脑屏障通透性损害,从而增加早期脑损伤的脑水肿程度,加重SAH后早期脑损伤的神经功能损伤作用。为了验证上述假设,本研究分三部分进行,第一部分采用视交叉池注血法建立大鼠实验性蛛网膜下腔出血模型,通过荧光定量RT-PCR、Western blot检测蛛网膜下腔出血后Nur77、磷酸化Nur77 (phosphorylated-Nur77,p-Nur77)、Bcl-2、cyto C的表达和神经功能损伤及脑水肿程度是否时间像上一致,并观察予以核受体Nur77特异性激动剂Cytosporone B(Csn-B)干预后对大鼠死亡率、神经功能损伤及脑组织含水量的影响,并通过免疫组化形态学检查法、Western blot观察脑细胞中上述分子的表达、TUNEL检测其对脑细胞损伤的影响,以明确激活Nur77依赖的凋亡通路是否对参与了SAH后早期脑损伤;第二部分则观察予以核受体Nur77抑制剂—环孢素A(Cyclosporin A)这一常见免疫抑制剂后,大鼠死亡率、神经功能损伤及脑组织含水量的改善,并通过免疫组化形态学检查法观察脑细胞中上述凋亡相关分子的表达、TUNEL检测其对脑细胞损伤的保护作用,以确定抑制激活Nur77是否可以减轻SAH后脑细胞凋亡,同时为SAH的药物研究提供一定理论依据。第三部分观察JNK、Akt等磷酸化酶对Nur77凋亡途径的调节作用。材料和方法观察核受体Nur77对SAH后早期脑损伤的神经损伤作用及其在脑细胞凋亡中的作用机制1.应用视交叉池注血法建立SD大鼠SAH模型;2 .第一部分实验将SD大鼠分为Normal正常组、Control(对照组)、SAH(蛛网膜下腔出血组),其中蛛网膜下腔出血组分12h、24h、48h、72h四个时间像3 .予以Csn-B (Nur77特异性激动剂)进行干预,以进一步明确Nur77和Bcl-2以及CytoC等凋亡相关分子的直接联系。分Control(对照组)、SAH(蛛网膜下腔出血组)、SAH+DMSO (SAH+溶剂组)以及SAH+Csn-B组(SAH+Nur77特异性激动剂组);4.第二部分实验予以常见的免疫抑制剂CsA (Nur77常见抑制剂)进行治疗,观察CsA对Nur77引起的神经损伤的保护作用。分Control(对照组)、SAH(蛛网膜下腔出血组)、SAH+DMSO (SAH+溶剂组)以及SAH+CsA组(SAH+Nur77抑制剂组);5 .分别测定各组大鼠脑组织含水量以及死亡率;并应用Garcina评分检测各组大鼠的神经行为功能;6.荧光定量RT-PCR以及Western Blot法检测SAH后各组大鼠伤后不同时间脑组织Nur77、p-Nur77、Bcl-2以及CytoC的mRNA以及蛋白表达水平;7.免疫组化检测上述蛋白在脑细胞中的免疫活性;8.通过Western blot检测各组凋亡最终蛋白Caspase3的表达水平,TUNEL检测明确Nur77对脑细胞损伤的影响;9.第三部分继续采用视交叉注血的大鼠实验性蛛网膜下腔出血模型,用药理学干预的方法,分别以JNK抑制剂SP600125和Akt的激动剂胰岛素为工具药,观察给予两者后阻断Nur77出核和转录活性的效果,以及能否改善SAH后实验动物死亡率、神经功能损伤、脑水肿程度和脑细胞凋亡的影响,以期验证Nur77的磷酸化在SAH后早期脑细胞凋亡的重要作用,以及SP600125和胰岛素对SAH后早期脑损伤的神经保护作用,为SAH后早期脑损伤治疗的药物开发研究提供新的线索。结果1. Nur77特异性激动剂Csn B明显加重大鼠实验性蛛网膜下腔出血后神经功能缺损;Nur77抑制剂CsA能够有效减轻大鼠实验性蛛网膜下腔出血后神经功能缺损,显著降低大鼠的死亡率。2. Nur77以及Nur77凋亡通路相关蛋白表达量的增高可有效增加脑组织含水量,加重神经功能损伤,证实Nur77激活的凋亡反应可引起脑组织水肿以及神经损伤作用;3. CsnB激活Nur77可以加重脑细胞凋亡及脑水肿程度,CsnA抑制Nur77激活对脑细胞凋亡有显著减轻作用,可以有效缓解脑组织水肿程度。两者进一步证实Nur77激活的凋亡反应对脑组织有损伤作用4.大鼠实验性蛛网膜下腔出血后Nur77及下游p-Nur77、Bcl-2以及cytoC表达增加,促进脑细胞发生凋亡,是蛛网膜下腔出血后早期脑损伤的主要病理损害机制之一。特异激动剂Csn-B激活Nur77的表达,可直接引起Bcl-2表达增加,促进线粒体cyto C释放,证实Nur77和Bcl-2反常的促凋亡行为直接相关。5. CsA能够显著降低大鼠实验性蛛网膜下腔出血后Nur77及相关蛋白的表达及cytoC释放,抑制凋亡反应,从而发挥神经保护作用。6.SP600125有效降低SAH后p-JNK、p-Nur77、Bcl-2、cytoC和caspase3的表达,抑制细胞凋亡的产生生,减少凋亡阳性细胞,进一步减轻脑水肿,并改善神经功能损伤7.胰岛素显著激活Akt,增加p-Nur77的表达,但通过抑制Nur77的结合功能,减低了 SAH后Bcl-2和cytoC的表达,降低凋亡阳性细胞的表达,减轻了脑水肿,改善神经功能。结论1.核受体Nur77激活能够增加大鼠实验性蛛网膜下腔出血后脑水肿及神经功能缺损,对早期脑组织具有神经功能损伤作用。2.大鼠实验性蛛网膜下腔出血后Nur77出核和Bcl-2结合,靶向线粒体,改变其抑制凋亡的作用,使其和线粒体结合、促进细胞色素C释放,最终导致细胞凋亡,是蛛网膜下腔出血后早期脑损伤的主要病理损害机制之一。3.Nur77特异激动剂能够显著增加大鼠实验性蛛网膜下腔出血后脑组织凋亡相关分子的转录及表达释放,促进脑细胞凋亡,从而发挥神经损伤作用。4. CsA这一临床常见药物能够显著减少Nur77的表达以及其介导的中枢脑细胞凋亡,从而发挥神经保护作用,有效减轻SAH后早期脑损伤5. Nur77的活化依赖磷酸酶的磷酸化,其中JNK对Nur77的磷酸化增强其促凋亡的生物活性,Akt对Nur77的磷酸化抑制结合Bcl-2的能力,进而抑制Nur77靶向线粒体发挥其促凋亡效应。