目的:作为凋亡抑制蛋白家族成员之一,Survivin及其相关的抗凋亡蛋白共同作用促进肿瘤细胞增殖,抑制细胞凋亡,是目前发现的最强的凋亡抑制因子,而Survivin的异常激活在包括食管癌在内的多种癌症里促进肿瘤细胞增殖,其在肿瘤组织中持续高表达的分子机制未见报道;Bad是Bcl-2蛋白家族成员之一,是细胞凋亡的正调控因子;我们以往的研究结果显示,Survivin是参与食管癌发生发展最重要的原癌基因。我们最新研究结果显示,新疆哈萨克族食管癌发生发展重要的原癌基因Survivin,在小样本癌组织中的表达水平与Bad呈负相关,并且在癌细胞中Bad在转录水平随Survivin的变化而改变。但目前Survivin与Bad之间的关系尚不清楚。我们推测,Survivin可能作为转录调控因子,调控Bad的表达。Survivin未知的调控作用将会打破对Survivin传统的认识。因此,本研究通过使用多种技术手段调控食管鳞癌细胞中survivin的表达,来探讨survivin是否通过下调Bad的表达抑制该基因的活性;最后对survivin调控Bad的作用位点,以及调控survivin的表达对细胞生物行为的影响进行研究。在本研究中,我们首先在食管鳞癌组织标本中确认Bad和Survivin的相关性;其次,采用RNA干扰、实时荧光定量PCR、Western blot、流式细胞技术等方法,在食管癌细胞株KYSE450,Eca109中,通过沉默或过表达Survivin检测Bad的mRNA与蛋白表达水平以及细胞周期凋亡状态;同时过表达Bad检测survivin和Bad在基因转录与蛋白表达水平以及细胞周期凋亡状态;并运用ChIP方法寻找Survivin调控Bad的证据;并用Survivin特异性抑制剂YM155在两种食管癌细胞系中通过抑制Survivin的活性而引起细胞凋亡,进而强烈抑制食管癌细胞增殖。同时研究survivin特异性抑制剂与传统化疗药Dox和VP-16联用时是否能增强食管鳞癌细胞对化疗敏感性,从而降低这些细胞对Dox和VP-16的药物耐受。方法:1.转录水平检测survivin和Bad mRNA在食管癌鳞状细胞癌组织与远端无癌组织中的表达差异及相关性分析,探讨survivin和Bad的表达在食管鳞癌组织中是否与其他病理临床指标是否具有相关性。2.构建Survivin的过表达载体及shRNA载体,使用电转染方法将质粒转染食管鳞状细胞癌的细胞株,全培养基培养的细胞作为空白对照组。48h后收集细胞提取总RNA和蛋白,使用RT-qPCR以及Western-blotting检测Survivin、Bad和Caspase-3的表达,验证转染效率及Bad与Survivin的调控关系。使用流式细胞仪对细胞的周期和凋亡情况进行检测,评估上调或者下调Survivin表达对细胞周期和凋亡的影响。3.染色质免疫共沉淀实验:为了证实Survivin蛋白能够通过与Bad启动子区的直接或间接结合来调控Bad启动子的转录活性,影响Bad的活化。我们将GV142-survivin过表达重组质粒转染入KYSE450和ECA109细胞,使用Survivin抗体免疫沉淀与Survivin蛋白结合的DNA片段,并使用针对Bad启动子区设计的特异性引物进行PCR扩增,以鉴定免疫沉淀的DNA片段。4.Survivin特异性抑制剂YM155以适当的浓度作用于ESCC KYSE450和KYSE510细胞,完全培养基处理细胞作为空白对照组。药物作用48h后进行细胞成像和细胞活力检测;同时提取细胞总蛋白,使用Western-blotting检测survivin、Bad、Caspase-3的表达水平,验证YM155是否通过抑制Survivin活性而引起细胞凋亡,进而抑制食管癌细胞的增殖。其次,用不同浓度的YM155,Dox,VP-16单独和共同处理ESCC KYSE450和KYSE510细胞。48h后提取细胞蛋白,用蛋白质免疫印迹法检测Bad,Caspase-3,PARP,验证YM155与传统的化疗药Dox和VP-16联合作用能否引起肿瘤细胞凋亡,是否增加食管癌细胞对化疗致敏,从而降低这些细胞对Dox和VP-16的药物耐受。5.细胞集落形成的软琼脂测定法是检测肿瘤细胞独立生存及迁移能力的一种方法,集落形成能力是评价肿瘤细胞恶性程度的重要指标。培养ESCC KYSE450和KYSE510细胞,将适当数量的细胞接种于含软琼脂/完全培养基的细胞培养板中,24h后将不同浓度的YM155加入到软琼脂胶状物顶层,将细胞培养板放入细胞培养箱中生长2至3周,当用显微镜观察到细胞集落在呈现出黄豆粒大小时用结晶紫染色,4h后用Bio-Rad凝胶成像系统拍照并用“Quantity One”软件对每孔集落数进行计数。验证YM155是否通过抑制Survivin的活性进而抑制肿瘤细胞的生长。结果:1.40对食管癌组织和对应的远端无癌组织中,survivin的阳性表达率为88%,远高于对应的远端无癌组织中47.5%的表达率,差异显著（P<0.05）;而Bad在远端无癌组织中的阳性率为95%,高于食管鳞癌组织中70%的阳性率,差异显著（P<0.05）;在食管癌组织中survivin的表达与低分化之间呈正相关（r=0.412,P=0.009）,而Bad与肿瘤分化程度之间没有相关性;Survivin和Bad的mRNA转录水平与其他各临床病理指标之间均无相关性。2.Survivin过表达质粒转染使得KYSE450和ECA109细胞中Survivin的mRNA转录水平和蛋白表达水平显著增高,而Bad的mRNA转录水平和蛋白表达水平显著降低;同时抑制了两种细胞的细胞凋亡,引起G2/M期的缩短,S期比率显著增多,并促进了细胞增殖。3.Survivin shRNA重组质粒转染KYSE450和ECA109细胞后,细胞中Survivin的mRNA转录和蛋白水平表达水平均显著降低,而Bad的mRNA转录和蛋白表达水平均显著增高;流式细胞检测显示,两种细胞的G1/S期转换受到明显抑制,细胞周期阻滞,细胞凋亡加剧。4.染色质免疫共沉淀实验显示,在KYSE450和ECA109细胞中,survivin蛋白可能与Bad启动子有结合位点。YM155可以抑制ESCC中survivin的活性,通过下调survivin的表达抑制KYSE450和KYSE510的细胞活力,抑制其生长并诱导细胞凋亡。此外,YM155能够抑制KYSE450和KYSE510细胞的集落形成潜力;YM155与Dox和VP-16联用可以显著提高KYSE450和KYSE510细胞对化疗的敏感性,从而降低两种细胞对Dox和VP-16的药物耐受。结论:1.在食管癌组织中,Survivin的表达高于对应的远端无癌组织,Bad的表达低于对应的远端无癌组织;survivin与Bad的转录具有相关性,survivin可能作为转录因子调控Bad的表达,两者之间为负调控关系。Survivin可能参与了食管鳞癌的发生及进程。2.在KYSE450和ECA109细胞株中,survivin蛋白可能是通过结合Bad的基因启动子区抑制Bad的转录,进而抑制肿瘤细胞的凋亡,促进肿瘤细胞增殖。3.在食管鳞癌细胞中,survivin可能参与细胞周期G1/S期转换,而促凋亡基因Bad不仅参与细胞凋亡,也参与细胞周期变化,延长G2/M期,抑制细胞增殖进而引起细胞凋亡。4.KYSE450和ECA109细胞株中,survivin蛋白与Bad的基因启动子区可能有结合位点,该位点可能位于Bad基因启动子区-500bp以内。小分子化合物YM155可以单独作用或与较低浓度Dox和VP-16联合作用促进肿瘤细胞凋亡,降低化疗药物毒性,抑制肿瘤细胞的增殖;本研究中survivin与Bad之间分子调控机制的发现,将为临床药物干预提供新的靶点,并可作为ESCC诊断和治疗中的新指标。