细胞是生物体形态结构和生命活动的基本单元,细胞内的多种亚细胞结构如线粒体、溶酶体、内质网、高尔基体、核糖体、细胞核等共同组成了细胞的基本结构。细胞及亚细胞结构中的一系列生物活性小分子,如活性氧、活性氮、活性硫及金属离子等,对于维持细胞及细胞器的正常生理功能,调控相关的病理生理学进程,具有至关重要的作用。活性小分子的化学性质活泼,易对生物大分子(蛋白质、核酸等)进行可逆或不可逆的结构修饰,进而调控相关生物大分子的功能。此外,活性小分子可通过多种方式穿越生物膜,是细胞器通讯的关键信号分子。因此,研究活性小分子的亚细胞分布及浓度变化,对于深入研究活性小分子的病理生理学功能,以及相关疾病的诊断和治疗,具有极其重要的意义。深入研究活性小分子的亚细胞分布及浓度变化,就需要发展在亚细胞水平具有高选择、高灵敏、高时空分辨的原位可视化示踪技术。鉴于活性小分子往往具有寿命短、活性高、浓度低等特点,基于荧光探针的荧光成像技术因其高灵敏、高时空分辨、非侵入性等特点而成为理想的研究工具。本论文致力于设计合成新型的具有亚细胞定位功能的分子荧光探针,对细胞器、组织及活体中的活性小分子进行荧光成像检测,并将探针应用于细胞及动物模型研究,揭示活性小分子的病理学效应及功能。本论文主要开展了如下两方面研究工作:(1)线粒体定位探针用于药致心脏毒性过程中过氧亚硝酸根的荧光成像检测。线粒体是真核细胞进行生物氧化和能量转换的主要场所。线粒体缺陷或者功能紊乱可诱发多种疾病,如神经退行性疾病、代谢类疾病、癌症等。线粒体氧化磷酸化过程伴随活性氧(ROS)的产生。过量的ROS会引起线粒体损伤,释放促凋亡因子,诱发细胞凋亡。过氧亚硝酸根(ONOO~-)是活性最强的ROS之一,能够对生物大分子进行氧化或硝基化结构修饰,诱导线粒体凋亡甚至细胞死亡。线粒体是ONOO~-产生并发挥生物学功能的主要场所。根据目前的文献报道,我们推测线粒体ONOO~-在蒽环类抗生素诱导心脏毒性过程中发挥着重要的作用。针对以上问题,本论文以尼罗红衍生物为荧光团,α-酮酰胺作为识别基团,设计合成了一种特异性响应ONOO~-的双光子激发、近红外发射的荧光探针。该探针能够高选择、高灵敏、快速响应ONOO~-,且能够定位于线粒体,能够对细胞线粒体及组织中的ONOO~-进行双光子荧光成像。采用该探针研究发现,心肌细胞线粒体内ONOO~-水平在蒽环类药物刺激后的早期凋亡阶段即出现升高,并且在启动和促进心肌细胞凋亡中起到关键作用,是引起心肌细胞凋亡和心肌组织损伤的重要因素。由此可见,ONOO~-水平可作为早期生物标志物预测药物引起的亚临床心脏毒性。该项研究对于药物诱导心脏损伤的诊断和治疗提供了重要线索。(2)溶酶体定位及酸性pH激活探针用于细胞及活体内甲醛的双光子荧光成像。溶酶体是含有多种酸性水解酶,内部pH值呈酸性(pH 4.5-5.5)的膜性细胞器。作为真核细胞重要的酸性细胞器,溶酶体在许多细胞生物过程如内吞作用、细胞生长和凋亡、自噬、铁离子稳态平衡、氧化应激等方面发挥关键作用。溶酶体及其内部参数的异常变化会导致溶酶体贮积病、阿尔茨海默症、癌症等。甲醛是一种高活性的内源性代谢产物,细胞内生理浓度范围约为0.1-0.4 mM。内源性甲醛可由脱甲基酶和氧化酶调控产生,甲醛浓度异常升高会诱导多种疾病的发生,如癌症、神经退行性疾病、糖尿病、慢性肝脏和心脏疾病等。溶酶体是甲醛产生及发挥生物学功能的重要细胞器,溶酶体异常将影响甲醛的浓度、亚细胞分布及生物学效应。因此,监测溶酶体内甲醛的浓度变化,对于了解甲醛的产生、分布及代谢过程,以及甲醛相关疾病的预防、诊断和治疗,具有非常重要的作用。针对上述问题,本论文设计合成了一种特异性响应甲醛的溶酶体定位探针。该探针只能在溶酶体的酸性环境中对甲醛响应,在细胞质及其他细胞器的中性环境中对甲醛无任何响应。因此,该探针能够特异性地准确检测溶酶体内的甲醛浓度。此外,该探针能够对细胞溶酶体及小鼠腹部组织中的甲醛进行原位双光子荧光成像。采用该探针研究发现,N-乙酰半胱氨酸能够清除细胞内的甲醛,在甲醛相关疾病的预防和治疗方面表现出一定的应用前景。综上所述,本论文设计合成了两种分别靶向线粒体和溶酶体的荧光探针,分别用于细胞、组织及活体中ONOO~-和甲醛的双光子荧光成像检测。两种探针均表现出良好的光学性质及响应性能。采用上述探针对细胞及动物模型进行研究,初步阐释了ONOO~-和甲醛的病理学效应及功能,为相关生物学研究提供了高效的原位荧光成像工具,为相关疾病的预防、诊断和治疗提供了有价值的线索。