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α-葡糖苷酶是一种广泛存在于生物体中、参与初级代谢反应的最重要的酶之一。它与多种疾病如糖尿病、癌症等相关,并且在工业生产和医药领域都有广泛的应用。本研究以来源于海洋嗜盐菌的α-葡糖苷酶Ha G为研究对象,以单晶X射线衍射为主要研究手段,通过解析其三维立体结构,结合生化学实验,从原子水平上阐明了其外在特殊性质的内在分子机制,建立了结构与功能之间的关系,为α-葡糖苷酶的改造和应用奠定基础。主要研究内容与结果如下:一、野生型Ha G的异源表达、纯化,晶体制备和结构解析将Ha G的基因克隆至表达载体p FLAG-CTS中,于大肠杆菌中进行过量表达。采用渗透休克法提取目的蛋白,并依次选用弱阴离子交换柱层析和分子排阻色谱等方法得到了高纯度、有活性的Ha G蛋白质样品。采用坐滴法进行蛋白质结晶,经过筛选和优化,成功地获得了可供衍射用的高质量蛋白质单晶。在日本同步辐射中心采集晶体衍射数据,通过分子置换法解析了Ha G的三维立体结构。Ha G在立体结构上分为主要负责催化的N末端结构域、维持构型稳定的C末端结构域以及一个亚结构域,其活性中心口袋由15个氨基酸残基构成,位于N末端结构域的(α/β)8桶状结构中间。二、Ha G及其突变体与配基复合体的晶体结构解析通过定点突变获得了没有催化活性的突变体E271Q、D202N和D333N,以共结晶或浸泡的方法筛选得到4种复合体晶体:(1)Glucosyl-Ha G,为野生型Ha G催化反应的中间体,体现了α-葡糖苷酶催化反应的真实过程;(2)E271Q-Mal,为GH13家族中首个α-(1,4)糖苷键类型的底物复合体结构,此结构中存在114个残基电子云密度缺失,推测此部分在反应发生时会移动,使底物顺利进入活性中心口袋;(3)D202N-Glu-Gly,模拟了以甘油为接受底物时的糖基转移反应,阐明了Ha G催化甘油生成甘油葡萄糖苷的反应特点;(4)D333N-Rb,利用重金属Rb+在特殊波长X射线下的异常信号确定了Rb+在晶体结构中的位置。三、Ha G底物特异性和催化反应机理的结构学基础通过将Ha G复合体结构与其他酶对比分析,并结合突变实验和酶学实验,阐明了Ha G底物特异性:(1)Ha G特有的超长(β→α)4无规则卷曲阻挡于活性中心入口处,决定了其对于短链底物的特异性;(2)底物糖苷键特异性是由两个残基Thr203和Phe297所决定的,同时,残基Gly228对糖苷键的识别也有辅助作用。并且,将所有的复合体结构联系起来,阐明了反应机理的分子机制,为经典的双替代理论提供了结构学基础。