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低温冷害在水稻生产中是导致水稻减产的最大非生物灾害,其中幼苗期冷害使植株枯黄、分蘖数减少,进而可引起植株生长发育受抑制,从而导致减产或绝收。因此了解水稻低温冷害发生的分子机制,从而改良水稻的耐冷特性及培育耐冷水稻新品种是解决低温冷害对水稻生产影响的关键。转录因子在冷胁迫信号传导中起到关键的调控作用,单个基因的表达可启动信号传导网络,从而激活下游与胁迫相关功能基因的转录及表达,从而达到改良植株耐冷性的效果。因此,挖掘耐冷转录因子基因,将为作物转基因育种提供功能更加显著的基因资源。本研究对野生型及miR319b超量表达水稻幼苗进行低温胁迫处理,通过Real-time RT-PCR方法,分析OsPCF6与OsTCP21表达特性,间接验证miR319b-OsPCF6/OsTCP21靶向关系。通过对OsPCF6与OsTCP21蛋白亚细胞定位分析、转录激活活性分析初步揭示了目的基因作为转录因子的特性。通过构建OsPCF6与OsTCP21超量及RNA干扰(RNAi)植物表达载体,对水稻进行遗传转化,获得了OsPCF6与OsTCP21超量及RNAi表达水稻植株。通过对野生型水稻、超量表达及RNAi表达植株进行冷胁迫处理,分析了OsPCF6/OsTCP21在冷胁迫中的功能；进一步通过分析OsPCF6与OsTCP21转基因植株中冷胁迫相关Marker基因表达特性、脯氨酸及H202含量,初步探讨了OsPCF6/OsTCP21调控植物耐冷分子机制。主要研究结果如下：1.OsPCF6/OsTCP21全长基因的克隆利用同源克隆的方法得到OsPCF6全长cDNA序列1854bp,OsTCP21全长cDNA序列2108bp,其中OsPCF6基因CDS区共1074bp,编码357个氨基酸,OsTCP21基因CDS区共1338p,编码445个氨基酸。2.水稻冷胁迫相关TCP基因的验证通过对冷胁迫处理后的Real-time RT-PCR结果分析,OsPCF6与OsTCP21在冷胁迫1h时下调表达,随着处理时间的增加其表达量有所升高,3h以后,OsPCF6与OsTCP21的表达量继而下降。Real-time RT-PCR间接验证miR319b-OsPCF6/OsTCP21靶向关系,同时说明了OsPCF6与OsTCP21对冷胁迫具有响应。3.OsPCF6/OsTCP21蛋白亚细胞定位分析通过GFP依赖的瞬时作用表达系统分析相关转录因子基因在细胞内的定位情况。构建了OsPCF6、OsTCP21蛋白与GFP融合的瞬时表达载体,通过基因枪轰击的方法在洋葱表皮细胞瞬时表达重组蛋白,激光共聚焦显微镜的观察结果表明OsPCF6与OsTCP21蛋白定位于细胞的细胞核内,可能参与了胁迫信号的感受和传导。它们作为一个转录调节子可能通过调控其他基因的表达,来调控植物对外界胁迫信号的传递。4.OsPCF6/OsTCP21转录激活活性分析利用酵母系统分析转录因子基因是否具有转录激活活性。构建转录因子基因全长cDNA序列的表达载体pGBKT7-OsPcf6和pGBKT7-OsTCP21,转化酵母,报告基因β-半乳糖苷酶活性检测表明：OsPCF6蛋白不具有转录激活功能；而OsTCP21蛋白具有转录激活功能。该结果表明OsPCF6可能作为转录抑制子起作用,而OsTCP21可能作为转录激活子起作用。5.OsPCF6/OsTCP21基因的超量表达及功能分析构建了融合有OsPCF6与OsTCP21的超量及RNAi植物表达载体,采用农杆菌介导法对水稻进行遗传转化,获得抗性植株。通过PCR,Southenr blot,Real time RT-PCR对抗性植株进行分子生物学检测,获得转基因植株。通过分析转OsPCF6与OsTCP21基因及野生型水稻植株冷胁迫处理后的表型,确定OsPCF6与OsTCP21基因的耐冷功能。通过分析T2代转基因及野生型水稻植株冷胁迫处理后的功能,确定了OsPCF6与OsTCP21超量表达植株对低温的敏感性增加,而RNAi植株对低温的耐冷性增加。6.OsPCF6/OsTCP21介导的冷胁迫应答分子机制通过对OsPCF6/OsTCP21超量及RNAi表达植株与野生型植株中冷胁迫相关Maker基因定量分析,我们发现冷胁迫后一些关键的Maker基因例如DREB/CBF类基因、H202清除类及脯氨酸诱导合成类等在过量表达植株下调表达而在RNAi表达植株中上调表达。DREB/CBF类基因在RNAi表达植株中转录水平有所提高,可促使该类转录因子的表达,从而诱导下游冷胁迫应答基因的表达,进一步提高水稻的耐冷性。OsPCF6与OsTCP21通过间接调控这些基因的表达,提高植物的冷胁迫耐性。