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本试验旨在制备单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-丝裂霉素纳米胶束并对其药效学进行评价。首先制备了单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸嵌段聚合物(mPEG-PLA),并利用红外光谱及H1NMR法对聚合物进行分析,确定聚合物的结构并对其进行表征;再采用丙酮溶解-挥发法制备mPEG-PLA-MMC纳米胶束,纳米胶束经过0.45um的微孔滤膜过滤除菌,将收集到的滤液经冷冻干燥得到mPEG-PLA-MMC胶束固体。胶束的粒径和形态采用透射电镜、原子力显微镜进行表征;利用紫外分光光度法测定mPEG-PLA-MMC纳米胶束的包封率和载药量;胶束粒子的纳米载体效应即突释、缓释效应的测定采用紫外分光光度法;临界胶束浓度(CMC)的测定采用的是荧光分光光度法;mPEG-PLA-MMC纳米胶束的释放研究采取以PBS为缓冲液、紫外分光光法测定;在体外试验中,采用MTT法研究mPEG-PLA嵌段聚合物对MMC药理作用的影响,主要实验用细胞为人胃腺癌BGC-823细胞、人肝癌HepG2细胞;体内试验采用小鼠肉瘤S180和肝癌腹水瘤H22模型研究了mPEG-PLA-MMC纳米胶束的药理作用,将其结果与单使用MMC相比较,研究胶束药物是否具有靶向性及是否对MMC的药理作用具有增强作用。一、单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸嵌段聚合物(mPEG -PLA)的制备及表征以单甲氧基聚乙二醇与D,L-丙交酯为原料,通过直接开环聚合反应制备mPEG-PLA嵌段聚合物。将mPEG与D,L-丙交酯置于真空干燥箱内,于70℃、0.1mPa压力下干燥2h。甲苯经蒸馏纯化备用。将mPEG与D,L-丙交酯按照一定质量比投入到密闭的三颈瓶内,以辛酸亚锡为催化剂、氮气保护条件下,140℃回流8h,反应结束得到单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸嵌段聚合物(mPEG-PLA)粗产品,经纯化得到较纯产品,颜色为白色或乳白色。嵌段聚合物的表征主要采取红外光谱法及H1NMR分析。经分析可以确定制备的样品为单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸嵌段聚合物(mPEG -PLA)。二、临界胶束浓度(CMC)的测定以荧光物质芘为探针,可以测定mPEG-PLA嵌段聚合物的CMC值,随着溶液中mPEG-PLA共聚物浓度的增加,芘的激发光强度增加,激发光波长逐渐红移。当共聚物浓度达到CMC值以上时,部分芘进入胶束中,I338/1333的比值发生明显变化,因此可以通过这明显变化的点来确定共聚物的CMC值。配制含有一定量芘的不同浓度的mPEG-PLA溶液,在荧光分光光度计下测定,结果显示CMC值为1.9mg/L。三、mPEG-PLA-MMC胶束的制备及表征1. mPEG-PLA-MMC胶束的制备:将mPEG-PLA嵌段聚合物与MMC按照不同的质量比混溶于一定体积的丙酮溶液中,不断搅拌使固体全部溶解。在通风橱内避光的条件下将溶液按照1滴/s的速度滴加到含有一定量三蒸水的烧杯内,烧杯内装有磁力搅拌子,使滴下的溶液与三蒸水混合均匀,通风条件下使丙酮尽量挥发完全。一定时间后,取出溶液,将其转移入经事先处理的透析袋内(透析袋的截留分子量≥5000d),在恒温水浴振荡器内透析,目的是使MMC游离出,而胶束得以保存。通过测定透析袋外的MMC的含量确定是否透析完全。等到透析结束,将透析袋内的胶束转移到经灭菌的0.45um微孔滤膜,过滤除菌。滤液收集到经高压灭菌的玻璃器皿内,于-20℃条件下预冻。预冻结束后将其转移到冷冻干燥机内,经冷冻干燥制备胶束固体。制备的mPEG-PLA-MMC纳米胶束在密封、避光、常温条件下保存。2、胶束的粒径、形态的表征2.1、透射电镜法透射电镜(TEM)结果显示:干燥胶束为球形微粒,可以形成核壳结构。中间发亮的为密度较大的疏水性的核即PLA,外周淡淡的一层为亲水性的mPEG。空白胶束的粒径在50nm左右,而载药胶束的粒径在80~100nm之间,粒径分布较均匀。2.2、原子力显微镜法配制一定浓度的胶束溶液,超声使其尽可能分离,以减少团聚现象。将超声后的溶液滴加到新鲜剥离的、平整的云母表面,固定5min,用滤纸将溶液吸干,置于空气中使其干燥完全。干燥完全后将样品置于原子力显微镜下观察测定。结果显示:胶束的粒径与透射电镜结果相一致。2.3、红外光谱法利用KBr压片法,在红外光谱仪中分析mPEG-PLA-MMC纳米胶束、mPEG-PLA空白胶束及mPEG-PLA空白胶束与MMC物理混合三种不同样品。通过比较红外光谱图,确定MMC确实存在于制备的复合物中。2.4、H1NMR法取适量样品,将其溶解到CH2DCCl3中,将溶液转移到核磁共振管内,在400MHz条件下进行分析。通过比较mPEG-PLA-MMC纳米胶束、mPEG-PLA空白胶束及mPEG-PLA空白胶束与MMC物理混合的核磁图片,确定MMC存在于mPEG-PLA嵌段共聚合物中,即制备了需要的mPEG-PLA-MMC纳米胶束。四、mPEG-PLA-MMC胶束载药量及包封率的测定及缓释研究在制备mPEG-PLA-MMC胶束的过程中,收集透析袋外的溶液,测定其中的游离MMC的吸光度,将其带入到MMC的标准曲线A=0.0042+0.0607*C (R=1.0000,P<0.0001)中,即可求得游离MMC的质量。在总的MMC中减去游离MMC的质量,即可求得mPEG-PLA-MMC胶束中MMC的质量,利用下面公式求载药胶束的载药量及包封率。经计算当mPEG-PLA嵌段聚合物与MMC的质量比为10:3时,载药胶束的载药量和包封率较好,载药量可达15%,包封率可达52%。称取一定量的载药胶束,将其溶解在一定体积的PBS中,将其转移到经事前处理的透析袋内(截留分子量≥5000d),将其密封后置于装有大量的PBS烧杯中,将烧杯置于恒温水浴振荡器内,设定好温度及速度,在预定的时间点及时更换固定量的新鲜PBS液体,直到利用紫外法无法检测到MMC为止。将各次含量相累加后与所对应的时间点作图,即可得到mPEG-PLA-MMC胶束的突释、缓释效果图。实验结果表明,载药胶束的突释现象不明显,而缓释效果明显,缓释时间为18±1d。五、mPEG-PLA对MMC体外杀伤癌细胞作用的研究体外试验旨在从体外的角度考察mPEG-PLA对MMC药理作用的影响。采用MTT法通过测定抑瘤率证明mPEG-PLA对MMC杀伤细胞是否有影响。试验中采用BGC-823细胞及Hepg2细胞作为实验对象。实验结果表明在体外mPEG-PLA嵌段聚合物对MMC的活性无增强作用,相反在较低剂量下mPEG-PLA-MMC纳米胶束的抗肿瘤活性较低,在高剂量下(200μg/ml及以上)两者无显著差异。考虑到mPEG-PLA-MMC纳米胶束的缓释效果,此实验结果的产生是合理的,低剂量下由于mPEG-PLA-MMC纳米胶束释放出的MMC较少,因此抑制作用较低,高剂量下MMC释放量较多,当MMC达到一定量时,对细胞的抑制作用相对稳定,所以两者之间差异不显著。六、mPEG-PLA对MMC体内抗肿瘤作用的影响及毒性研究体内试验通过对小鼠肉瘤S180模型抑瘤率和小鼠肝癌腹水瘤H22模型生命延长率的影响,观察了mPEG-PLA嵌段聚合物在体内对MMC的增效作用。毒性研究采用BABL/C小鼠,一系列剂量给药,观察组织损伤情况。1、小鼠肉瘤S180模型以小鼠肉瘤S180为试验模型,mPEG-PLA嵌段聚合物可以显著增加MMC在体内的抗肿瘤作用。mPEG-PLA-MMC纳米胶束剂量为2、6、18mg/kg时对肿瘤的抑制作用为31.23%、51.78%、66.80%,而MMC剂量为1mg/kg时对肿瘤的抑制作用为34.78%。mPEG-PLA-MMC纳米胶束中MMC的含量约为1/6,因此mPEG-PLA-MMC纳米胶束为6mg/kg时与单使用MMC1mg/kg剂量相当。数据显示:mPEG-PLA-MMC纳米胶束剂量为2mg/kg时与单使用MMC剂量1mg/kg对肿瘤的抑制作用相当,在中高剂量下对肿瘤的抑制作用显著增加,具有统计学意义(P<0.001)。2、小鼠肝癌腹水瘤H22模型以小鼠肝癌腹水瘤H22为试验模型,mPEG-PLA-MMC纳米胶束组能显著延长荷瘤小鼠的生存时间,延长生命延长率。mPEG-PLA-MMC纳米胶束剂量为2、6、18mg/kg时生命延长率分别为76.6%、171.0%、206.5%,而MMC剂量为1mg/kg时生命延长率为123.4%。数据显示:mPEG-PLA-MMC纳米胶束剂量为2mg/kg时与单使用MMC剂量1mg/kg对生命延长率的作用低,两者之间差异具有统计学意义(P<0.01),在剂量为6、18mg/kg时与单使用MMC剂量1mg/kg对小鼠生命延长作用显著增加,具有统计学意义(P<0.01)。3、局部组织损伤实验试验结果表明:mPEG-PLA-MMC纳米胶束可以显著降低MMC对组织的损伤作用。mPEG-PLA-MMC纳米胶束组在组织损伤出现的时间较MMC组晚,发生率也低,损伤面积较小。mPEG-PLA-MMC纳米胶束组发生损伤的最低剂量为0.08mg,MMC实验组为0.02mg;mPEG-PLA-MMC纳米胶束组组织损伤面积相对同剂量的MMC较小,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。