目的:以多药耐药相关蛋白（Multidrug resistance-associated protein,MRP）为切入点,以MRP功能、机体氧化应激状态、线粒体功能通路为主线,研究大黄素对整体动物的潜在毒性作用机制,通过对比不同剂量的大黄素对青年及老年小鼠肝肾毒性差异,进一步阐明大黄素时、量与年龄差异性的微观毒理学机制。方法:1.衰老小鼠模型的建立:采用D-半乳糖125mg/kg/d通过颈背部皮下注射到25周龄小鼠体内,连续注射60d。流式细胞术检测小鼠胸腺T细胞亚群CD⁺₂₈及CD₄⁺/CD₈⁺比例,检验模型是否建立成功。2.长期给予不同剂量大黄素对小鼠肝肾毒性选取5周龄小鼠作为青年组,D-半乳糖造模小鼠作为老年组,分别分为空白组、大黄素低剂量组和大黄素高剂量组。大黄素低剂量组给药剂量为0.8g/kg,大黄素高剂量组给药剂量为1.6g/kg,连续灌胃给药75天。1)肝毒性:通过检测血清AST、ALT活力,采用苏木素-伊红（HE）染色法评价小鼠肝脏细胞形态学,免疫组化法检测肝脏caspase3的表达,评价不同剂量大黄素对小鼠肝脏的毒性差异;2)肾毒性:通过检测血清Cr、BUN含量,HE染色法评价小鼠肾脏细胞形态学,免疫组化法检测肾脏TGF-β1和caspase3的表达,评价不同剂量大黄素对小鼠肾脏的毒性差异。3)大黄素对小鼠体内氧化应激的影响:通过对血清MDA含量和SOD活力,肾匀浆液的GSH-Px活力和GSH/GSSG比值,肝脏线粒体膜电位及线粒体对Ca²⁺诱发肿胀的敏感性的检测,揭示大黄素毒性与氧化应激的关系。4)大黄素对小鼠肝脏MRP蛋白表达的影响:westernbolt检测MRP1和MRP2蛋白的表达,揭示大黄素与MRP家族的内在联系。结果:1.衰老小鼠模型的建立:D-半乳糖组胸腺T细胞CD₄⁺/CD₈⁺比值和CD⁺₂₈的比例较对照组显著下降,说明衰老模型建立成功。2.长期给予不同剂量大黄素对小鼠肝肾毒性1)肝脏毒性:HE染色切片可见:青年及老年给药组小鼠肝脏均出现不同程度细胞肿胀和脂肪变性,病理评分显示随剂量增大肝脏损伤越严重。与青年空白组比较,青年给药组小鼠AST活力均有上升,且高剂量组上升更显著。与老年空白组比较,老年组高剂量给药组小鼠AST活力值有显著上升。青年及老年组中各给药组caspase3数量较空白组均有上升趋势。2)肾脏毒性:HE染色切片可见:青年及老年给药组小鼠肾脏均出现不同程度细胞肿胀、蛋白管型、充血及淋巴细胞增生,病理评分显示随剂量增大肾脏损伤越严重。与青年空白组比较,青年给药组Cr和BUN均有显著上升;青年组给药小鼠TGF-β1光密度呈上升趋势,且高剂量组有统计学差异;caspase3阳性细胞数量较空白组均有明显上升。与老年空白组比较,老年给药组Cr和BUN含量均有上升趋势,其中高剂量组有统计学意义。老年给药组TGF-β1光密度均呈上升趋势,且各组均有统计学差异,低剂量组caspase3阳性细胞数量有显著上升,但高剂量组无明显变化。3)大黄素对小鼠体内氧化应激的影响:与青年空白组比较,青年组给药小鼠SOD活力均有显著下降;肝脏GSH-Px活力和GSH/GSSG比例均有不同程度降低;肾脏GSH-Px活力值均呈下降趋势,GSH/GSSG比例较空白组均有下降,且高剂量组下降显著;肝组织线粒体膜电位均有下降趋势,且高剂量组下降显著。与老年空白组比较,老年给药组SOD活力均有下降趋势;大黄素高剂量组肝脏GSH-Px活力和GSH/GSSG比例有上升;肾脏GSH-Px活力均有下降趋势,GSH/GSSG比例变化不明显;肝组织线粒体膜电位均有下降趋势,且高剂量组下降有统计学差异。线粒体对Ca²⁺诱发肿胀的敏感性结果显示:各给药组FSC/SSC比值均无显著差异。4)大黄素对小鼠肝脏MRP蛋白表达的影响:不同浓度的大黄素可下调青年小鼠肝脏MRP1及MRP2蛋白的表达,且高剂量组与青年空白组对比有显著下调;对老年小鼠,大黄素可上调小鼠肝脏MRP1及MRP2蛋白的表达,且高剂量组与老年空白组对比有显著上调。结论:大黄素对青年及老年肝肾毒性的表达潜在机制可能存在差异,具体如下:1.对于青年小鼠:1)大黄素诱发小鼠氧化应激损伤,使GSH抗氧化系统功能失衡,通过破坏细胞线粒体功能,激活caspase凋亡通路导致细胞凋亡,最终表现为大黄素的肝肾毒性;2)大黄素可能通过下调MRP1和MRP2的表达,使小鼠体内出现氧化应激,是大黄素毒性的启动因子。2.对于老年小鼠:长期大剂量服用大黄素最终表现为增强MRP1和MRP2的表达,其作用机制可能为:用药初期,大黄素诱导MRP表达减弱,使得MRP表达本就较弱的老年机体GSH抗氧化系统功能失衡,诱发过度氧化应激,在长期大剂量用药后触发机体防御机制启动,最终表现为MRP表达增强。